長(zhǎng)鏈非編碼基因CASC11在結(jié)直腸癌增殖、遷移中的作用和分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　本課題擬檢測(cè)CASC11在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況;分析其表達(dá)量的改變與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系;通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證其在結(jié)直腸癌中的功能作用;并研究CASC11在結(jié)直腸癌中的具體作用機(jī)制;探討CASC11異常表達(dá)的上游調(diào)控機(jī)制。
　　方法:
　　1.CASC11在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況
　　(1)采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time quantitative PCR，qRT-PCR)檢測(cè)36

2、例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本及其配對(duì)的正常組織中CASC11的表達(dá)。檢測(cè)CASC11在結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、SW620、HT29、LOVO、Ls174t、RKO、M5、HCT116和永生化結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC中的表達(dá)情況。
　　(2)根據(jù)臨床樣本資料分析CASC11在組織樣品中的表達(dá)情況與腫瘤大小、分期和轉(zhuǎn)移等相關(guān)臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　2.CASC11對(duì)結(jié)直腸癌體內(nèi)外生物學(xué)特性的影響
　　(1)將病毒轉(zhuǎn)染至SW480和SW6

3、20細(xì)胞中，建立穩(wěn)定干擾CASC11表達(dá)的SW480和SW620細(xì)胞亞系。將過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SW620、RKO細(xì)胞系中，構(gòu)建瞬時(shí)過表達(dá)CASC11的細(xì)胞亞系。并用qRT-PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證。
　　(2)通過CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，平板克隆實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)，Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾或過表達(dá)CASC11的細(xì)胞株體外增殖和遷移能力。
　　(3)將已構(gòu)建成功的穩(wěn)定干擾細(xì)胞株SW480-pLV-shCASC11和SW4

4、80-PLV-shNC注射至裸鼠皮下，4周后檢測(cè)腫瘤的大小以觀察CASC11穩(wěn)定干擾的細(xì)胞株在體內(nèi)的增殖能力;尾靜脈注射以建立CASC11干擾細(xì)胞株的體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型，并于8周后檢測(cè)裸鼠肝臟和肺臟的轉(zhuǎn)移情況。
　　3.CASC11與靶基因之間的相互作用
　　(1)通過RNA-pull-down實(shí)驗(yàn)拉下CASC11基因的結(jié)合蛋白，經(jīng)過銀染質(zhì)譜分析，結(jié)合文獻(xiàn)選出感興趣的結(jié)合蛋白不均一核糖體蛋白K(Heterogeneous ribo

5、nucleoprotein K，hnRNP-K)，并用Western blot和RIP實(shí)驗(yàn)鑒定二者之間的結(jié)合。
　　(2)干擾或過表達(dá)CASC11，檢測(cè)hnRNP-K的表達(dá)量改變。觀察CASC11是否對(duì)hnRNP-K有調(diào)節(jié)作用。
　　(3)通過核漿RNA分離實(shí)驗(yàn)，觀察CASC11在結(jié)腸癌細(xì)胞中的定位，根據(jù)其定位于胞漿或胞核結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)推測(cè)其功能機(jī)制。加入放線菌酮D后檢測(cè)CASC11的改變對(duì)hnRNP-K穩(wěn)定性的影響。

6、　　(4)改變hnRNP-K的表達(dá)，檢測(cè)CASC11表達(dá)的改變，觀察hnRNP-K是否對(duì)CASC11有反作用。
　　4.CASC11通過hnRNP-K對(duì)WNT通路活性的調(diào)節(jié)作用
　　(1)通過GSEA基因富集的方法，利用公共數(shù)據(jù)庫GEO數(shù)據(jù)分析結(jié)直腸癌中CASC11高表達(dá)組中上調(diào)的信號(hào)通路（WNT信號(hào)通路）。
　　(2)通過TOP/FOP雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)WNT活性改變，通過qRT-PCR和Westernblot檢

7、測(cè)WNT通路靶基因的改變。
　　(3)利用蛋白的核漿分離，檢測(cè)CASC11改變后β-catenin和hnRNP-K入核量的改變。并通過進(jìn)一步改變hnRNP-K的表達(dá)情況，檢測(cè)CASC11對(duì)WNT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)是否通過hnRNP-K起作用。
　　(4)通過COIP檢測(cè)hnRNP-K和WNT通路里重要蛋白的結(jié)合情況，初步推測(cè)hnRNP-K在WNT信號(hào)激活過程中的可能作用。
　　5.結(jié)直腸癌中CASC11的上游調(diào)控機(jī)制

8、>　　(1)TRANSFAC網(wǎng)站預(yù)測(cè)CASC11啟動(dòng)子區(qū)域是否有c-Myc結(jié)合位點(diǎn)，并通過CHIP實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證c-Myc是否能結(jié)合在CASC11啟動(dòng)子部位并促進(jìn)CASC11表達(dá)。
　　(2)上調(diào)或下調(diào)c-Myc表達(dá)后，用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)CASC11的表達(dá)情況，再次驗(yàn)證c-Myc是否能作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)CASC11表達(dá)，并分析二者之間相關(guān)性。
　　(3)UCSC數(shù)據(jù)庫觀察CASC11啟動(dòng)子部位有乙?；?/p>

9、變，并通過CHIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)乙?；课弧z測(cè)c-Myc是否可以調(diào)節(jié)CASC11啟動(dòng)子區(qū)乙?；M(jìn)而調(diào)節(jié)CASC11的表達(dá)。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果:
　　1.CASC11在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)且與結(jié)直腸癌的大小、分期和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　(1)CASC11在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)
　　熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，在36對(duì)結(jié)直腸癌組織中，CA

10、SC11在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)有32對(duì)高于周圍正常粘膜組織(P＜0.001)。在結(jié)直腸癌細(xì)胞LOVO，M5，LS174t，RKO，SW620，SW480，HT29，HCT116中CASC11的表達(dá)均高于永生化結(jié)腸細(xì)胞FHC(P＜0.05)。
　　(2)CASC11表達(dá)水平和臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系
　　臨床病理分析結(jié)果顯示，CASC11的表達(dá)水平在年齡、性別和分化上沒有顯著差異(P＞0.05)，而在腫瘤大小、TNM分期、局部浸

11、潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上有差異且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.CASC11在結(jié)直腸癌進(jìn)展過程中的作用
　　(1)CASC11干擾和過表達(dá)載體的構(gòu)建
　　構(gòu)建了CASC11干擾的慢病毒載體和過表達(dá)CASC11的表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序鑒定結(jié)果顯示插入的序列正確，無突變、缺失或者框移。
　　(2)CASC11干擾和過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響
　　CCK8結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比CASC11穩(wěn)定干擾的細(xì)胞生長(zhǎng)速

12、度顯著下降(P＜0.001)，過表達(dá)的細(xì)胞生長(zhǎng)速度則明顯快于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　(3)CASC11干擾和過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響
　　Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CASC11干擾組細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少(P＜0.001)，而CASC11過表達(dá)組細(xì)胞遷移數(shù)量明顯增多(P＜0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CASC11干擾組細(xì)胞與對(duì)照組相比較，遷移速度明顯減慢（P＜0.001）。
　　3

13、.CASC11可以促進(jìn)靶基因hnNRP-K的表達(dá)
　　(1)hnRNP-K是CASC11的靶基因
　　RNA-pull down結(jié)果顯示CASC11可以與hnRNP-K蛋白相結(jié)合，CASC11拉下的蛋白用hnRNP-K抗體做Westernblot驗(yàn)證結(jié)果為陽性。用hnRNP-K抗體做RIP，結(jié)果顯示hnRNP-K抗體能結(jié)合CASC11的RNA。
　　(2)CASC11可以調(diào)節(jié)hnRNP-K的表達(dá)
　　CASC11

14、干擾的細(xì)胞株分別用qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)SW480和SW620細(xì)胞中hnRNP-K的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示hnRNP-K表達(dá)明顯降低，相反CASC11過表達(dá)則引起hnRNP-K的表達(dá)水平增高，說明CASC11可以調(diào)節(jié)hnRNP-K表達(dá)。
　　(3)CASC11可以增加hnRNP-K的穩(wěn)定性
　　(4)hnRNP-K對(duì)CASC11有反作用，二者之間具有相關(guān)性
　　在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中干擾或過表達(dá)hnRNP-

15、K，做qRT-PCR可以引起CASC11的表達(dá)量出現(xiàn)相應(yīng)的改變，說明hnRNP-K對(duì)CASC11是有反作用的。
　　4.CASC11通過hnRNP-K激活WNT通路及下游的靶基因
　　(1)CASC11高表達(dá)的結(jié)直腸癌組織中信號(hào)通路分析
　　GSEA基因富集分析結(jié)果顯示，在基因芯片GSE8671數(shù)據(jù)中，WNT通路在CASC11高表達(dá)的結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，并且通路相關(guān)基因富集(P＜0.05)。
　　(2)CASC1

16、1可以調(diào)節(jié)WNT通路活性及下游靶基因的表達(dá)
　　IHC和qRT-PCR結(jié)果均顯示在CASC11干擾后，WNT通路下游靶基因β-catenin，c-Myc，CycinD1和MMP7表達(dá)降低;增加CASC11表達(dá)量，則WNT通路下游靶基因β-catenin，c-Myc，CycinD1和MMP7表達(dá)隨之增高。
　　(3)CASC11通過hnRNP-K激活WNT通路
　　CASC11是通過hnRNP-K來起作用。
　　(

17、4)CASC11通過hnRNP-K激活WNT通路的可能機(jī)制
　　hnRNP-K可能在β-catenin入核的轉(zhuǎn)運(yùn)或和TCF4結(jié)合中也起了作用。
　　5.結(jié)直腸癌中CASC11的上游調(diào)控機(jī)制
　　(1) c-Myc作為轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控CASC11的表達(dá)
　　(2) c-Myc能增強(qiáng)CASC11啟動(dòng)子區(qū)域乙?；⑦M(jìn)一步促進(jìn)CASC11表達(dá)
　　結(jié)論:
　　1.CASC11在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)增加，且與結(jié)直

18、腸癌的大小、漿膜浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期相關(guān)，在結(jié)直腸癌中發(fā)揮癌基因的作用。
　　2.干擾CASC11表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力;過表達(dá)CASC11則促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。
　　3.hnRNP-K是CASC11的靶基因，CASC11通過增加hnRNP-K的穩(wěn)定性來促進(jìn)其表達(dá)。hnRNP-K的表達(dá)對(duì)CASC11具有正反饋?zhàn)饔谩?br>　　4.CASC11通過hnRNP-K激活WNT通路活性。
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