利拉魯肽對(duì)體外誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝細(xì)胞LC3Ⅱ、p62表達(dá)的影響.pdf

1、目的:通過(guò)觀察胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-like peptide-1，GLP-1）受體激動(dòng)劑利拉魯肽干預(yù)體外誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型，檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)指標(biāo)LC3Ⅱ、p62的變化，及細(xì)胞凋亡情況的變化，探討利拉魯肽對(duì)非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的治療作用效果及機(jī)制。
　　方法:用含10％胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM

2、培養(yǎng)液于體外培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞-L02細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基中加入油酸、棕櫚酸（2:1）誘導(dǎo)肝脂肪變性，建立NAFLD模型。細(xì)胞分組:1）正常對(duì)照組;2） NAFLD模型組；3）NAFLD模型組+利拉魯肽治療組+高脂培養(yǎng)液組:高脂培養(yǎng)液中加入濃度為10nmol/L利拉魯肽;4）NAFLD模型組+利拉魯肽治療組+正常培養(yǎng)液組:正常培養(yǎng)液中加入濃度為10nmol/L利拉魯肽;5）正常組+利拉魯肽:正常培養(yǎng)液中加入濃度為10nmol/L利拉魯肽；各組

3、分別干預(yù)48h，收集樣品。應(yīng)用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)肝細(xì)胞中甘油三酯(Triglyceride,TG)的含量及上清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine Aminotransferase, ALT)的水平，試劑盒檢測(cè)丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）含量，采用油紅“O”染色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)脂滴情況。采用qRT-PCR檢測(cè)LC3Ⅱ、p62 mRNA的表達(dá)，Western

4、blot檢測(cè)微管相關(guān)蛋白1-輕鏈3(microtubule- associated protein1 light chain3,LC3)、真核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)調(diào)控蛋白P62(sequestosome1,SQSTM1)蛋白表達(dá)的變化；采用TUNNEL分析法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況的變化。明確利拉魯肽改善人肝細(xì)胞系NAFLD模型療效的部分機(jī)制。數(shù)據(jù)分析：所得數(shù)據(jù)采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)

5、及方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)于符合正態(tài)分布的采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，對(duì)于不符合正態(tài)分布的采用K-W秩和檢驗(yàn)，以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.利拉魯肽對(duì)正常L02細(xì)胞的TG、ALT、SOD、MDA水平、LC3Ⅱ、p62 mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響（P＞0.05）。
　　2.與正常對(duì)照組比較，NAFLD組細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增多，TG、ALT、MDA水平升高，SOD水平降低，LC3Ⅱ

6、mRNA和蛋白表達(dá)均降低，p62 mRNA蛋白表達(dá)增加，凋亡指數(shù)增加，差異均有顯著性（P＜0.05）。
　　3.與NAFLD細(xì)胞模型組比較，NAFLD細(xì)胞模型+利拉魯肽治療+高脂培養(yǎng)液組、NAFLD細(xì)胞模型+利拉魯肽治療+正常培養(yǎng)液組細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯減少，TG、ALT、MDA水平下降，SOD水平明顯升高，LC3Ⅱ mRNA和蛋白表達(dá)均升高，p62 mRNA蛋白表達(dá)減少，凋亡指數(shù)下降，差異均有顯著性（P＜0.05）。
　　4.與

7、NAFLD細(xì)胞模型+利拉魯肽治療+正常培養(yǎng)液組比較，NAFLD細(xì)細(xì)胞胞模型+利拉魯肽治療+高脂培養(yǎng)液組內(nèi)脂滴減少幅度較低，TG、ALT、MDA水平下降幅度減少，SOD水平升高，LC3Ⅱ、p62 mRNA和蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡指數(shù)水平改變幅度較低，差異均有顯著性(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.在體外成功建立非酒精性脂肪肝的細(xì)胞模型；
　　2.GLP-1受體激動(dòng)劑利拉魯肽可減輕肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，改善肝細(xì)胞功能。