羅仙子初提物的抗衰老藥效及其抗氧化機(jī)制初探.pdf

1、衰老是一種自然的，持續(xù)發(fā)生的變化過(guò)程。自由基學(xué)說(shuō)（Free radicle theory，F(xiàn)R）是最具代表性的衰老學(xué)說(shuō)之一，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為自由基損傷人體細(xì)胞，從而引起眾多疾病，加速人體衰老?？寡趸穷A(yù)防衰老的重要步驟，抗氧化劑是任何以低濃度存在就能有效抑制自由基氧化反應(yīng)的物質(zhì)，開(kāi)發(fā)實(shí)用、高效、低毒的天然抗氧化劑是今后研究的重點(diǎn)。中藥羅仙子原名家蠅蛆，俗稱蛆，其成蟲家蠅常出沒(méi)于污穢之地，置身于不計(jì)其數(shù)的病菌（包括寄生蟲、病毒、細(xì)菌、甚至是抗生

2、素耐藥的細(xì)菌等）之中，卻能安然無(wú)恙，不被這些病原體感染，這源于其優(yōu)異的免疫功能。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的研究人員對(duì)羅仙子的研究，大多集中在活性肽上，他們發(fā)現(xiàn)羅仙子提取物中富含凝集素、溶菌酶、抗菌蛋白等活性成分，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒等病原體和抗腫瘤細(xì)胞的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期在研究羅仙子提取物對(duì)高脂血癥大鼠血脂調(diào)節(jié)及肝臟保護(hù)的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，羅仙子提取物使肝臟勻漿中超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）的活性明顯升高，丙二醛

3、（Malondialdehyde，MDA）水平明顯下降，提示羅仙子提取物可能具有通過(guò)清除自由基來(lái)增強(qiáng)抗氧化能力的作用。隨著研究的深入，一些研究還發(fā)現(xiàn)了羅仙子提取物可以清除自由基和抵抗重金屬脅迫，但是大多都只是研究了家蠅幼蟲初提物的清除自由基方面。本研究通過(guò)D-半乳糖（D-galactose，D-gal）致衰老小鼠模型和自然衰老大鼠模型對(duì)羅仙子初提物的抗衰老藥效進(jìn)行評(píng)價(jià)并初步探討其抗氧化機(jī)制，在此基礎(chǔ)上，初步摸索了羅仙子初提物的酶解工藝，

4、為從傳統(tǒng)中藥羅仙子中開(kāi)發(fā)出一種抗衰老候選藥物分子提供理論基礎(chǔ)，也為羅仙子抗氧化肽的提取分離打下基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.利用D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠模型評(píng)價(jià)羅仙子初提物的抗衰老藥效及其抗氧化機(jī)制昆明小鼠48只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、衰老模型組、維生素E（Vitamin E，Vit E）對(duì)照組和羅仙子初提物低、中、高劑量組，每組8只。除正常對(duì)照組外，其余各組均按10 mg/kg給予D-gal頸背部皮下注射，每日一次，連續(xù)注射6周

5、，同時(shí)Vit E組和羅仙子初提物低、中、高劑量組按10 ml/kg灌胃給藥。造模給藥0 d始，每天測(cè)定小鼠的體重，并觀察各組小鼠形態(tài)行為學(xué)的改變；造模給藥第30 d時(shí)，進(jìn)行小鼠避暗實(shí)驗(yàn)；造模給藥6周后處死小鼠，檢測(cè)小鼠血清、肝臟和腦組織中各項(xiàng)抗氧化相關(guān)指標(biāo)。
　　2.利用自然衰老大鼠模型評(píng)價(jià)羅仙子初提物的抗衰老藥效及其抗氧化機(jī)制
　　10-11月齡的大鼠在SPF環(huán)境飼養(yǎng)9個(gè)月，飼養(yǎng)至19-20月齡，隨機(jī)分為5組，分別為：衰老

6、模型組、Vit E對(duì)照組和羅仙子初提物低、中、高劑量組，每組8只。青年對(duì)照組在衰老模型組的大鼠造模且臨近給藥的前10天購(gòu)進(jìn)，適應(yīng)性飼養(yǎng)10天。羅仙子初提物各劑量組和Vit E組按10 ml/kg，灌胃給藥，每日一次，連續(xù)2個(gè)月。青年對(duì)照組和衰老模型組給予同體積的生理鹽水。造模給藥0d始，每月測(cè)定大鼠的體重，并觀察各組大鼠形態(tài)學(xué)的改變；給藥結(jié)束進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)后，大鼠注射乙醚麻醉，腹主動(dòng)脈取血；取血后迅速取出腦組織。
　　

7、3.初步酶解羅仙子初提物
　　利用Alcalase堿性蛋白酶對(duì)羅仙子初提物進(jìn)行酶解，高效液相色譜分析（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）酶解前后組分差異，并測(cè)定其清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinit-rophenyl)hydrazyl)，DPPH·）

8、自由基的活性；在此基礎(chǔ)上，采用單因素分析酶解條件（具體為pH、溫度、底物濃度、加酶量和酶解時(shí)間等）對(duì)酶解的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.利用D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠模型評(píng)價(jià)羅仙子初提物的抗衰老藥效及其抗氧化機(jī)制
　　與正常對(duì)照組相比，衰老模型組小鼠體重增加速率明顯減慢，學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退，小鼠血清，肝臟，腦組織中的SOD活性和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）活力均降低，MD

9、A含量增加。與衰老模型組相比，Vit E組和羅仙子初提物各劑量組體重增加速率升高，學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)，小鼠血清，肝臟，腦組織中的SOD活性升高，MDA含量減少，GSH-PX活力增強(qiáng)。
　　2.利用自然衰老大鼠模型評(píng)價(jià)羅仙子初提物的抗衰老藥效及其抗氧化機(jī)制
　　與青年對(duì)照組相比，衰老模型組大鼠活動(dòng)緩慢，皮膚污穢無(wú)澤，體重隨周齡的增加不明顯；Morris水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)中存在潛在的學(xué)習(xí)記憶功能障礙；大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)中神經(jīng)元胞質(zhì)

10、，胞體和突起中出現(xiàn)溶酶體；胞體中線粒體出現(xiàn)腫脹，線粒體中嵴的溶解和消失；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，網(wǎng)腔的擴(kuò)張，游離核糖體密度降低，數(shù)量減少，分布不均，呈不規(guī)則排列，扭曲和膨脹，且有部分游離到了細(xì)胞質(zhì)中；神經(jīng)突觸間隙及突觸前、后膜結(jié)構(gòu)模糊，神經(jīng)突觸連接變少；腦組織中SOD活性和GSH-PX活力降低，MDA含量升高。與衰老模型組相比，Vit E組和羅仙子初提物各劑量組體重隨周齡增加，學(xué)習(xí)記憶功能障礙減輕，大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)中神經(jīng)元胞質(zhì)，胞體和突起中溶

11、酶體數(shù)量減少；胞體中線粒體腫脹減弱，線粒體中嵴的溶解情況也得到了緩解；神經(jīng)突觸間隙及突觸前、后膜結(jié)構(gòu)較清晰；腦組織中的SOD活性升高，MDA含量減少，GSH-PX活力增強(qiáng)。
　　3.初步酶解羅仙子初提物
　　對(duì)羅仙子初提物進(jìn)行酶解后，通過(guò)HPLC上樣分析和測(cè)定其清除DPPH·自由基活性發(fā)現(xiàn)，酶解前后的羅仙子初提物的色譜圖譜存在差異，且酶解后的羅仙子初提物具有更好的清除DPPH·的活性。通過(guò)后續(xù)對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，酶解時(shí)

12、的底物濃度，酶解pH和酶解溫度對(duì)酶解效率的影響較大，而加酶量和酶解時(shí)間對(duì)酶解效率的影響較小。
　　結(jié)論：
　　本研究分別利用D-gal致亞急性衰老小鼠模型和自然衰老大鼠模型綜合評(píng)價(jià)羅仙子初提物的抗衰老藥效，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，D-gal致亞急性衰老小鼠模型及自然衰老組大鼠與正常對(duì)照組對(duì)比，均出現(xiàn)衰老的癥狀；而羅仙子各劑量組和Vit E組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物衰老癥狀均有所減輕；通過(guò)觀察各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為，測(cè)定體內(nèi)抗氧化相關(guān)指標(biāo)，檢測(cè)超微結(jié)構(gòu)等，

13、分析發(fā)現(xiàn)羅仙子初提物可能通過(guò)清除自由基等作用來(lái)提高機(jī)體的抗氧化能力，進(jìn)而改善超微結(jié)構(gòu)的一些衰老癥狀，從而達(dá)到延緩衰老的作用。對(duì)羅仙子初提物進(jìn)行初步酶解后，通過(guò)HPLC上樣分析和測(cè)定其清除DPPH·自由基活性發(fā)現(xiàn)，酶解前后的羅仙子初提物的色譜圖片存在差異，說(shuō)明羅仙子初提物酶解后，確實(shí)水解出了某些具有抗氧化活性的小分子多肽。通過(guò)后續(xù)初步對(duì)酶解條件的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，酶解時(shí)底物濃度，酶解pH和酶解溫度對(duì)酶解效率的影響較大，而加酶量和酶解時(shí)間對(duì)酶解效率