COLD-PCR用于混合檢材中微量等位基因富集的可行性.pdf

1、背景：來自兩個或兩個以上個體的混合檢材是法醫(yī)物證檢驗中經(jīng)常遇到的疑難檢材類型之一。隨著高靈敏檢測技術、高多態(tài)性和性連鎖等特殊遺傳標記的普及應用，從混合檢材中獲取證據(jù)信息的能力不斷提高。但即使對于經(jīng)驗豐富的專家來說，實際案件中一些混合檢材的檢測和結果解釋仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。如何對組份含量差異較大的混合檢材中的少量成份進行分型，是當前法醫(yī) DNA分析的難題之一。
　　目的：建立人類 Y染色體 M175插入/缺失基因座的 COLD-P

2、CR(co-ampLification atlower denaturation temperature PCR)技術，比較COLD-PCR與常規(guī)PCR對不同比例混合樣品的擴增分型效果，初步探討COLD-PCR用于法醫(yī)混合檢材中低水平等位基因富集擴增分型的可行性。
　　方法：首先建立人 Y-M175基因座的常規(guī) PCR-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PCR-PAGE）銀染法分型技術，調查103名河南漢族男性無關志愿者的基因型。用蛋白酶 K消

3、化-酚/氯仿法提取插入和缺失型個體的基因組 DNA，按不同比例混合制備成混合樣品。用梯度保溫異源雙鏈消減法測定 M175大擴增子(171/166bp)的臨界變性溫度（criticaldenaturation temperature，Tc），高分辨率熔解率曲線法（high resolution melting analysis，HRM）測定M175短擴增子(91/86bp)的Tc值。以Tc值為基礎，通過在常規(guī)PCR的變性和退火之間增加擴增

4、產(chǎn)物雜交和異源雙鏈變性兩個步驟，分別建立和優(yōu)化基于 PAGE-銀染法（大擴增子）和實時定量法（小擴增子）的 COLD-PCR技術，比較常規(guī) PCR和 COLD-PCR對不同比例混合樣品的擴增分型效果。
　　結果：河南漢族 Y-M175基因座插入和缺失型的頻率分別為0.1650、0.8350。M175大擴增子的 Tc值為76.4℃，小擴增子的 Tc值為78.4℃，優(yōu)化后采用的COLD-PCR異源雙鏈變性溫度分別為76.4和78.2℃