從DC-Th軸探討CD86-siRNA基因修飾樹突狀細(xì)胞在變應(yīng)性鼻炎中的作用研究.pdf

1、目的:
　　變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是發(fā)生在鼻粘膜的變態(tài)反應(yīng)性疾病，其發(fā)病以兒童和青壯年居多。據(jù) WHO近年公布的數(shù)據(jù)表明全世界目前超過5億人罹患此病。流行病學(xué)資料也顯示，在2008年美國變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病率高達(dá)16.7％，在慢性病中居第5位，而AR也是兒童最常見的慢性疾病，每年用于診治變應(yīng)性鼻炎的費用高達(dá)數(shù)十億美元。而在我國，2007年公布的國內(nèi)11個中心城市的流行病學(xué)資料，成人自報患病率介于9-24

2、.6%，兒童則介于1.8-13.67%。變應(yīng)性鼻炎雖不會引起嚴(yán)重后果，但能很大程度影響患者日常生活質(zhì)量。目前，對變應(yīng)性鼻炎最常用的治療方案是鼻噴糖皮質(zhì)激素和口服抗組胺藥，該方法雖然能快速控制鼻過敏性炎癥，有效緩解臨床癥狀，卻不能阻止變應(yīng)性鼻炎反復(fù)發(fā)作，距治愈的目標(biāo)尚遠(yuǎn)。研究表明，僅有約60%的患者對變應(yīng)性鼻炎的治療總體上感到非常滿意，且隨著時間的推移，藥物治療的療效會逐漸減弱，這些治療上的困難究其原因在于變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了

3、，難以探索出更為有效的治療手段。因此，加大對變應(yīng)性鼻炎發(fā)病機(jī)制的研究和防治措施的探討是目前耳鼻咽喉科學(xué)領(lǐng)域高度重視和急待解決的重點之一。
　　變應(yīng)性鼻炎的病因尚不明確，一般認(rèn)為與特應(yīng)性個體、遺傳學(xué)背景及環(huán)境因素有關(guān)。大量的實驗研究證實，鼻變態(tài)反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制是以Th2反應(yīng)為主的變態(tài)反應(yīng)性疾病，即Th1/Th2失衡引發(fā)的下游生物效應(yīng)導(dǎo)致變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生，但最近隨著研究的進(jìn)一步深入，有些學(xué)者提出新識別的T細(xì)胞亞群可能對Th2細(xì)胞的分化有

4、調(diào)節(jié)作用，如CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對Th2細(xì)胞所介導(dǎo)的呼吸道變應(yīng)性炎癥發(fā)揮強(qiáng)大的抑制作用。變應(yīng)性個體可能存在Treg/Th2失衡，但其復(fù)雜的信號傳導(dǎo)途徑和機(jī)制仍在研究和探索中，這必將為變應(yīng)性鼻炎提供新的治療靶點。
　　DC是體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞，也是唯一能使初始T淋巴細(xì)胞活化的APC，在免疫系統(tǒng)中處于啟動、調(diào)控并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。有研究證實變應(yīng)性鼻炎體內(nèi)Th2的極化狀態(tài)與DC細(xì)胞的功能異常有關(guān)， DC成為

5、研究影響T細(xì)胞活化與增殖的重要靶細(xì)胞。未成熟DC由于其表面缺乏共刺激因子，在體內(nèi)或體外均顯示出誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的特性,因此采用基因修飾的方法對DC加以修飾，使其保持穩(wěn)定的未成熟DC的特性，從而達(dá)到抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化而增強(qiáng)Treg細(xì)胞活化的目的。
　　本課題擬以AR為研究對象，闡明AR中是否存在Treg/Th2失衡并以DC-Th細(xì)胞間相互作用為主線，以慢病毒載體CD86-siRNA對DC的調(diào)控為切入點，闡述AR中基因修飾DC對Tr

6、eg/Th2失衡的調(diào)控，說明Th失衡的上游事件及其免疫調(diào)控因素，為AR發(fā)病機(jī)制的研究提供新的思路。
　　方法:
　　1、納入排除標(biāo)準(zhǔn)：本研究嚴(yán)格按照中華醫(yī)學(xué)會變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南（2009，武夷山），所有入組患者均來自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院耳鼻咽喉科門診，均為首次診斷，未接受變應(yīng)性鼻炎相關(guān)治療，對照組排除有感染性的、占位性的、藥物誘導(dǎo)性鼻炎和有任何并發(fā)癥的患者，在獲得其家長知情同意后，將其納入研究對象。
　　2、

7、探討AR患者與正常對照外周血中Treg/Th2細(xì)胞亞群分布及與臨床癥狀的關(guān)系、Treg/Th2相關(guān)細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)差異。
　?。?）按照ELISA試劑盒操作步驟檢測AR患者與正常對照外周血中總IgE、IL-4、IL-5、TGF-β1的含量。
　?。?）RT-PCR擴(kuò)增檢測外周血轉(zhuǎn)錄因子FOXP3、GATA-3mRNA表達(dá)情況。
　?。?）采用Western Blot方法檢測AR患者及正常對照組外周血PBMC中F

8、OXP3、GATA-3蛋白水平。
　　3、慢病毒載體 siRNA序列轉(zhuǎn)染人樹突狀細(xì)胞沉默 CD86基因?qū)reg/Th2細(xì)胞分化的影響
　?。?）慢病毒載體siRNA的構(gòu)建
　?。?）MACS分選人外周血CD14＋單核細(xì)胞并誘導(dǎo)成熟DC
　?。?）MACS分選人外周血CD4＋T細(xì)胞
　?。?）攜帶特異性siRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染DC
　?。?） AR組未轉(zhuǎn)染DC、轉(zhuǎn)染后DC、正常對照組DC與外周血CD4＋

9、T細(xì)胞共培養(yǎng)
　　將未轉(zhuǎn)染DC、轉(zhuǎn)染后DC與外周血CD4＋T細(xì)胞共培養(yǎng)，按照ELISA試劑盒操作步驟檢測共培養(yǎng)上清液中 IL-4、IL-5、TGF-β1的含量，RT-PCR法檢測FOXP3、GATA-3mRNA水平，Western Blotting方法檢測FOXP3、GATA-3蛋白水平，以評價CD86基因修飾后DC對Th細(xì)胞分化的影響。
　　結(jié)果:
　?。?）AR組與對照組相比，血清總IgE水平、嗜酸性粒細(xì)胞比例、T

10、5SS均明顯升高，且血清總IgE水平、嗜酸性粒細(xì)胞比例與T5SS呈正相關(guān)，而TGF-β1/IL-4、TGF-β1/IL-5、FOXP3 mRNA/GATA3 mRNA、FOXP3 protein/GATA3 protein比值與T5SS呈負(fù)相關(guān)。
　?。?）ELISA檢測AR血清中IL-4, IL-5，TGF–β1的表達(dá)，AR組與對照組相比，IL-4, IL-5明顯增高，而TGF-β1的水平AR組明顯低于對照組。
　　RT-

11、PCR檢測Treg轉(zhuǎn)錄因子FOXP3 mRNA的表達(dá)，AR組明顯低于對照組，而AR組Th2轉(zhuǎn)錄因子GATA3 mRNA的表達(dá)明顯高于對照組。
　　Western blotting檢測 FOXP3與 GATA3蛋白表達(dá)水平，結(jié)果GATA3, FOXP3蛋白表達(dá)趨勢與二者mRNA的表達(dá)趨勢一致。
　?。?）應(yīng)用MACS法從血液中成功提取CD14+單核細(xì)胞并刺激轉(zhuǎn)化成熟DC，成功提取CD4+T淋巴細(xì)胞，建立共培養(yǎng)體系（DC/CD4

12、+T1:4）；應(yīng)用CD86-siRNA慢病毒成功轉(zhuǎn)染DC，MOI值20，轉(zhuǎn)染率約為60.2%；轉(zhuǎn)染后DC表面分子標(biāo)志CD86的表達(dá)明顯下降；AR組未轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后DC及正常對照組DC分別與CD4+T共培養(yǎng)，上清液中Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5在siRNA轉(zhuǎn)染后其表達(dá)水平明顯低于未轉(zhuǎn)染組，但仍明顯高于正常對照組，而Treg型細(xì)胞因子TGF-β1在AR未轉(zhuǎn)染組的表達(dá)低于正常對照，siRNA轉(zhuǎn)染后其表達(dá)明顯高于未轉(zhuǎn)染組，但仍低于正常對照組

13、; Th2型轉(zhuǎn)錄因子 GATA3 mRNA水平及蛋白表達(dá)水平siRNA轉(zhuǎn)染后明顯低于未轉(zhuǎn)染組，但高于正常對照組，而Treg型轉(zhuǎn)錄因子FOXP3 mRNA水平及蛋白表達(dá)水平，AR組轉(zhuǎn)染后表達(dá)高于未轉(zhuǎn)染組，二組均低于正常對照組。
　　結(jié)論:
　　AR患者體內(nèi)FOXP3 mRNA和蛋白表達(dá)降低，而GATA3 mRNA和蛋白表達(dá)升高，F(xiàn)OXP3 mRNA/GATA3 mRNA、FOXP3蛋白/GATA3蛋白與AR的疾病嚴(yán)重程度（T5

14、SS）呈負(fù)相關(guān),提示AR患者體內(nèi)可能存在另外一種免疫失衡即Treg/Th2失衡。
　　通過體外細(xì)胞共培養(yǎng)實驗，應(yīng)用攜帶特異性CD86-siRNA序列慢病毒載體轉(zhuǎn)染人樹突狀細(xì)胞沉默CD86基因，結(jié)果顯示樹突狀細(xì)胞表面分子CD86的表達(dá)明顯減少，這種穩(wěn)定的、未成熟DC影響了T細(xì)胞的分化，表現(xiàn)為Treg表達(dá)升高而Th2細(xì)胞表達(dá)降低，提示AR患者可以通過基因修飾DC來調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化，即改變Treg/Th2平衡，從而說明DC-Th軸在AR