肝臟癌前病變的發(fā)生機制研究.pdf

1、本文從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 肝臟癌前病變的發(fā)生機制研究
　　研究目的:
　　世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)在1978年首次明確定義癌前病變(Precancerous Lesions)為“一種更容易發(fā)生惡性腫瘤的組織學(xué)改變”。癌前病變發(fā)生惡性腫瘤的風(fēng)險顯著高于其他組織，但并非所有的癌前病變均會進展為惡性腫瘤。高級別不典型增生結(jié)節(jié)（High Grade Dyspla

2、stic Nodules，HGDN）是肝癌的癌前病變，HGDN是指“肝組織有異型增生但又未達到惡性腫瘤標準，具有高度惡性潛能的，直徑1mm以上的不典型增生結(jié)節(jié)”。HGDN是一種真正處于良惡性臨界狀態(tài)的肝組織，其進展為肝癌的風(fēng)險顯著高于其它非惡性結(jié)節(jié)，如增生性大結(jié)節(jié)(Large RegenerativeNodules，LRN)、低級別不典型增生結(jié)節(jié)(Low Grade Dysplastic Nodules，LGDN)等。據(jù)統(tǒng)計，HGDN患

3、者發(fā)生肝癌的風(fēng)險是LGDN的四倍，其五年內(nèi)進展為肝癌的風(fēng)險高達60-80％。由此可知，HGDN是調(diào)控肝臟惡性腫瘤發(fā)生的一個關(guān)鍵節(jié)點，如果能有效控制甚至逆轉(zhuǎn)HGDN，那么就能大大降低肝癌的發(fā)病率。但是，目前與肝臟癌前病變相關(guān)的研究少之又少，其具體發(fā)生機制仍然鮮為人知。因此，我們希望通過對HGDN的形成，以及HGDN進展為肝癌的分子機制進行深入研究，尋找控制甚至逆轉(zhuǎn)HGDN的分子靶標，以期最終能夠降低肝癌的發(fā)病率。
　　研究方法:

4、r>　　1.精準獲取臨床HGDN組織樣本:運用激光捕獲顯微切割技術(shù)(Laser CaptureMicrodissection，LCM)精準割取同一患者肝臟石蠟樣本中的正常組織、HGDN組織和肝癌組織。
　　2.HGDN組織中microRNA表達譜鑒定:抽提LCM所獲取肝組織中的microRNA，利用microRNA低密度表達譜芯片檢測正常組織、HGDN組織和肝癌組織中的microRNA表達特點;運用microRNA動態(tài)網(wǎng)絡(luò)標志物分

5、析技術(shù)(Dynamic Network BiomarkerAnalysis，DNB)篩選出HGDN中異常表達的microRNA。
　　3.研究目標microRNA在正常肝細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的生物學(xué)功能:通過soft-agar克隆形成實驗、皮下荷瘤實驗、retrorsine小鼠肝細胞原位移植實驗、分選DEN誘癌小鼠原代HGDN細胞荷瘤實驗、尾靜脈注射antagomir實驗以及相關(guān)標志物檢測等，深入研究目標microRNA在肝細胞惡性

6、轉(zhuǎn)化過程中的相關(guān)功能。
　　4.構(gòu)建相關(guān)基因敲除小鼠并建立誘癌模型:我們構(gòu)建了miR-484組成型敲除小鼠(miR-484-/-)，并購買了Ⅰ型干擾素受體組成型敲除小鼠（Ifnar1-/-）;通過對上述小鼠進行DEN誘癌，進一步研究miR-484和Ⅰ型干擾素信號通路在肝臟癌前病變形成和肝癌發(fā)生過程中的功能及意義。
　　5.機制探索:運用熒光定量PCR實驗、報告基因?qū)嶒?、ELISA實驗、ChIP實驗、相關(guān)抑制劑實驗、基因敲除細

7、胞實驗以及敲除小鼠體內(nèi)試驗等，深入研究miR-484調(diào)控肝細胞惡性轉(zhuǎn)化和HGDN形成的具體分子機制。
　　6.臨床印證:通過一系列的免疫組化實驗、ELISA實驗以及原位雜交實驗，印證本研究中相關(guān)基因在臨床樣本和小鼠DEN誘癌樣本中的表達情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.明確了肝臟癌前病變中microRNA的表達特征，發(fā)現(xiàn)miR-449b，miR-545，miR-484，miR-320，miR-625#，miR-661和m

8、iR-29a#等在HGDN中異常高表達。
　　2.發(fā)現(xiàn)miR-484能誘導(dǎo)正常肝細胞惡性轉(zhuǎn)化并增強其成瘤能力。
　　3.DEN誘癌時下調(diào)miR-484能通過抑制癌前病變的形成影響肝癌的發(fā)生。
　　4.miR-484-/-小鼠DEN誘癌發(fā)現(xiàn)癌前病變的形成和肝癌的發(fā)生均顯著減少。
　　5.持續(xù)低劑量的Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)依賴于miR-484啟動子區(qū)的H3K27高乙?；?H3K27Ac)作用，選擇性誘導(dǎo)miR-48

9、4表達;而異常高表達的miR-484能進一步誘導(dǎo)IFN-Ⅰ生成，形成一個正反饋環(huán)路，最終促進肝細胞惡性轉(zhuǎn)化。
　　6.Ifnar1-/-小鼠DEN誘癌后，20周時，敲除組肝中miR-484并未高表達，且其形成癌前病變明顯少于野生小鼠;40周時，其肝癌的大小和數(shù)量也顯著降低。
　　7.在臨床肝臟組織和血液樣本中，miR-484與IFN-Ⅰ表達量相關(guān)。
　　研究結(jié)論:
　　本研究首次明確了肝臟的癌前病變HGDN中mi

10、croRNA的表達特征，發(fā)現(xiàn)了其中異常高表達的microRNA。我們在動物水平和細胞水平證實:肝臟的慢性炎癥或DNA損傷等誘導(dǎo)產(chǎn)生的低劑量Ⅰ型干擾素，依賴于miR-484啟動子區(qū)H3K27Ac的作用，選擇性誘導(dǎo)miR-484生成;而異常高表達的miR-484又能誘導(dǎo)IFN-Ⅰ的生成，形成了一個正反饋環(huán)路，最終誘導(dǎo)正常肝細胞惡性轉(zhuǎn)化，促進肝臟癌前病變的形成和腫瘤的發(fā)生。本研究首次發(fā)現(xiàn)低劑量的IFN-Ⅰ具有促進HGDN形成和肝癌發(fā)生的作用，

11、相關(guān)結(jié)果為控制甚至逆轉(zhuǎn)肝臟的癌前病變HGDN提供了一些潛在的治療靶標。
　　第二部分 CYP3A5在肝細胞癌中通過調(diào)控mTORC2/Akt信號通路發(fā)揮腫瘤抑制功能
　　研究目的:
　　細胞色素P450家族通過對內(nèi)源性或外源性物質(zhì)的代謝在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，其中CYP3A亞家族的作用尤為顯著。CYP3A亞家族含量最多、底物譜很大，是代謝反應(yīng)中最主要的限速酶之一。CYP3A亞家族包括4個主要成員，即CYP3

12、A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43。由于CYP3A7主要存在于胎肝，而CYP3A43最近才被發(fā)現(xiàn)，故這兩個成員的具體功能尚不明確;現(xiàn)今關(guān)于CYP3A亞家族研究最多的是它的兩個主要成員:CYP3A4和CYP3A5。其中，CYP3A4在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)功能已經(jīng)有較為充分的研究，它能活化前致癌物，且能參與抗腫瘤藥物的代謝;而CYP3A5是研究得最深入的CYP3A亞家族低豐度成員，但是相關(guān)研究仍主要集中于腫瘤發(fā)生和藥物代

13、謝這兩個方面，且相關(guān)研究主要是一些流行病學(xué)統(tǒng)計結(jié)果，對CYP3A5在腫瘤發(fā)展過程中的具體生物學(xué)功能則缺乏深入研究。
　　研究方法:
　　1.利用網(wǎng)絡(luò)基因芯片公共數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)CYP3A5在癌和癌旁的表達水平差異。
　　2.運用免疫組織化學(xué)染色方法分析CYP3A5原位表達差異，并根據(jù)組織芯片組化染色結(jié)果進行CYP3A5與臨床-病理特征的相關(guān)性分析。
　　3.利用臨床肝癌標本和不同轉(zhuǎn)移能力肝癌細胞系分析CYP3A5在

14、不同轉(zhuǎn)移能力肝癌組織和細胞株中的表達水平差異。
　　4.肝癌細胞株過表達CYP3A5后進行遷移、侵襲、粘附等轉(zhuǎn)移相關(guān)表型的體外、體內(nèi)實驗研究。
　　5.利用免疫印跡、siRNA、免疫共沉淀、酶譜分析、免疫組化染色等技術(shù)，深入研究CYP3A5調(diào)控肝細胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子機制。
　　研究結(jié)果:
　　1.CYP3A5的表達水平在肝細胞癌組織中顯著低于對應(yīng)癌旁組織。
　　2.CYP3A5表達水平的高低與肝癌轉(zhuǎn)移潛

15、能呈負性相關(guān)，且與預(yù)后直接相關(guān)。
　　3.體外實驗和體內(nèi)試驗同時證明，過表達CYP3A5能明顯抑制肝癌細胞的遷移、侵襲和粘附能力。
　　4.CYP3A5通過抑制AKT信號通路活性，調(diào)節(jié)TIMP1、TIMP2的表達和MMP2、MMP9的活性。
　　5.CYP3A5通過單純阻斷mTORC2激酶活性而非影響mTORC2復(fù)合物結(jié)構(gòu)，選擇性下調(diào)AKT的磷酸化水平(Ser473)。
　　6.CYP3A5通過誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞內(nèi)高水

16、平的ROS抑制mTORC2的激酶活性，進而抑制AKT(Ser473)活化，最終影響肝癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)表型。
　　研究結(jié)論:
　　本研究發(fā)現(xiàn)，CYP3A5表達水平在肝細胞癌組織中較癌旁組織明顯下調(diào)。我們運用大樣本的肝細胞癌組織芯片驗證發(fā)現(xiàn)，這種表達差異與肝細胞癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)臨床和病理指標存在顯著相關(guān)性，即CYP3A5表達水平與肝細胞癌轉(zhuǎn)移潛能呈負性相關(guān)。體外和體內(nèi)實驗進一步證明過表達CYP3A5可以顯著抑制肝癌細胞的遷移、侵襲和粘附

17、能力，且這種轉(zhuǎn)移相關(guān)表型的抑制作用主要是通過下調(diào)AKT信號通路活性，上調(diào)TIMP1、TIMP2表達水平和下調(diào)MMP2、MMP9的活性來實現(xiàn)的。通過深入的實驗研究，我們發(fā)現(xiàn)CYP3A5介導(dǎo)的AKT(Ser473)活化減弱是mTORC2/p-AKT(S473)途徑依賴的。同時，我們首次報道了CYP3A5通過誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生高水平的ROS，從而在不影響mTORC2復(fù)合物穩(wěn)定性的情況下單純抑制mTORC2的激酶活性，最終抑制了p-AKT所介導(dǎo)的肝細