雞CD3和IL-2分子單克隆抗體的研制與鑒定.pdf

1、雞CD3分子是T細(xì)胞表面的重要標(biāo)志之一，在抗原識(shí)別過程中，CD3分子參與信號(hào)傳導(dǎo)。針對(duì)雞CD3分子的特異性單克隆抗體(McAb)可用于測(cè)定或分選雞體內(nèi)CD3+T細(xì)胞群，從而了解雞體的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，進(jìn)行細(xì)胞免疫機(jī)理的深入研究。雞白細(xì)胞介素2(chickeninterleukin-2，ChIL-2)是主要由激活的T細(xì)胞和部分B細(xì)胞產(chǎn)生的一種糖蛋白，可激活T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分泌抗體，增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性等，是一種天然的免疫增強(qiáng)劑。

2、針對(duì)雞IL-2的特異性McAb可用于建立簡(jiǎn)單、快速、敏感性高的雞IL-2檢測(cè)方法，同時(shí)為IL-2在禽類免疫系統(tǒng)中的免疫生物學(xué)研究提供有用的工具。本研究分別用表達(dá)雞CD3和IL-2分子的重組真核表達(dá)質(zhì)粒免疫6周齡BALB/c小鼠，制備出能穩(wěn)定分泌抗雞CD3和IL-2分子的特異性McAb細(xì)胞株，并對(duì)McAb的部分生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，為其進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 一、重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IL-2的構(gòu)建及表達(dá)通過PCR擴(kuò)增出雞IL-2

3、cDNA片段，并將其克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IL-2，經(jīng)酶切鑒定正確后轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，間接免疫熒光結(jié)果顯示，雞IL-2能在真核細(xì)胞中獲得表達(dá)。 將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-IL-2轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，重組菌小量提取質(zhì)粒后經(jīng)酶切鑒定正確；將重組菌用IPTG(0.1mM終濃度)誘導(dǎo)4h后，收獲細(xì)菌，SDS-PAGE結(jié)果表明目的蛋白成功表達(dá)；誘導(dǎo)菌經(jīng)超聲波裂解后，分

4、別取沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示，目的蛋白主要以包涵體形式存在；包涵體經(jīng)PBS洗滌3次后得到初步純化，將其溶于6M鹽酸胍溶液。 二、雞IL-2McAb的研制與鑒定應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，以重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IL-2免疫6周齡BALB/c小鼠，100μg/只，后腿肌肉注射，間隔時(shí)間為2～3周，加強(qiáng)免疫后7d左右按常規(guī)方法融合，以原核表達(dá)雞IL-2蛋白為檢測(cè)抗原，間接ELISA篩選陽性克隆，共獲得抗雞IL

5、-2McAb2株，分別命名為：1H10和1E6。腹水效價(jià)分別為：1∶6400和1∶3200；亞類鑒定結(jié)果均為IgM。轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果表明，2株McAb均與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-2的COS-7細(xì)胞反應(yīng)。Western-blot結(jié)果顯示，兩株McAb均與23KD條帶處的融合蛋白His-ChIL-2發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)一步證明McAb1H10和1E6是針對(duì)雞IL-2的特異性McAb。 三、雞CD3McAb的研制與鑒定將重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcD

6、NA3.1-CD3免疫6周齡BALB/c小鼠，100μg/只，后腿肌肉注射，免疫間隔時(shí)間為2～3周。加強(qiáng)免疫后一周左右取小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0-Ag-14融合，以雞的脾細(xì)胞為檢測(cè)抗原，用間接免疫熒光結(jié)合ELISA方法進(jìn)行篩選，共獲得抗雞CD3McAb7株，分別命名為：IA10、3E3、3G10、5F3、8D1、9E7和15A11；7株McAb的腹水IFA效價(jià)在1∶800～1∶6400之間，ELISA效價(jià)在1∶3200～1∶25

7、600之間；亞類鑒定結(jié)果表明，除15A11為IgG2a外，其余均為IgM。用這些McAb的細(xì)胞上清作為一抗來檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CD3的COS-7細(xì)胞中CD3分子的表達(dá)，結(jié)果均呈陽性。用間接免疫熒光測(cè)定制備的抗雞CD3McAb的反應(yīng)譜，結(jié)果顯示，9E7、5F3和3E3腹水與狼山雞、大骨雞、仙居雞、北京油雞、絲羽烏骨雞、白耳雞、尤溪麻雞和清遠(yuǎn)麻雞的脾淋巴細(xì)胞均能反應(yīng)，其它McAb與這些品種雞的脾細(xì)胞反應(yīng)不一。用制備的抗雞CD3雜交瘤