HBV相關慢加急性肝衰竭的全基因組關聯(lián)研究及主要位點HLA-DR功能解析.pdf

1、HBV相關慢加急性肝衰竭(HBV-related acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF)是中國及亞太地區(qū)慢性肝病患者常見的危急重癥，臨床上表現(xiàn)為短期內出現(xiàn)高膽紅素血癥、凝血酶原時間延長（INR≥1.5），起病迅速，病死率高，缺乏特異治療手段。
　　目前認為HBV-ACLF的發(fā)生主要與宿主遺傳因素、病毒以及宿主免疫相互作用有關，但是其確切的發(fā)病機制尚不明確。近年來，西方基于酒精性肝硬化的AC

2、LF的研究報道較多，認為酒精性肝硬化相關ACLF患者從急性發(fā)作、炎癥損傷、免疫失調到系統(tǒng)性炎癥反應綜合征(systematic inflammatory response syndrome，SIRS)、代償性抗炎反應綜合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS)、再生反應等多環(huán)節(jié)事件的幅度和次序，決定著患者是炎癥消退-康復還是進展到肝外器官衰竭，系統(tǒng)性炎癥反應是酒精性

3、肝硬化患者發(fā)生ACLF的主要驅動因素。
　　慢性HBV感染者是否發(fā)生肝炎發(fā)作，發(fā)作后是否進展為肝衰竭，由于HBV缺乏慢性感染的動物模型，且ACLF的病因和誘因存在很大的異質性，目前對HBV相關ACLF的肝臟免疫學應答及免疫病理過程仍然知之甚少。既往針對HBV病毒序列變異的研究認為C基因啟動子區(qū)、前C區(qū)和C區(qū)變異與乙型肝炎的發(fā)作及暴發(fā)性肝衰竭相關。但是，同樣的前C、C區(qū)變異既可以見于不同的病變表型（普通乙型肝炎、肝硬化、肝癌），也可

4、見于無癥狀攜帶者。事實上，病毒變異是否導致乙型肝炎重癥化的發(fā)生和發(fā)展，受到宿主因素的制約。乙型肝炎的發(fā)生、發(fā)展和轉歸，是病毒（病毒載量、變異、進化）和宿主（遺傳異質性、年齡、性別等）通過免疫應答相互作用導致的常見復雜疾病。
　　常見復雜疾病(common complex diseases)通常由許多微效累加基因與環(huán)境因素共同作用而決定的。HBV-ACLF的發(fā)生、發(fā)展，涉及到免疫識別、炎癥活化/放大、肝細胞壞死、SIRS、CARS、

5、器官衰竭等多個環(huán)節(jié)，也屬于常見復雜疾病的范疇，其遺傳因素也涉及多個微效基因的作用。在復雜疾病遺傳易感性研究中，關聯(lián)研究-連鎖不平衡分析方法最為常用，統(tǒng)計效能也遠高于家系連鎖分析。基于全基因組策略的遺傳關聯(lián)研究，是目前復雜疾病遺傳關聯(lián)研究的主流，與候選基因策略相比其優(yōu)點在于統(tǒng)計效能有著極大的提高，同時可以避免群體分層偏倚和基因選擇的偶然性，可以從全基因組角度獲得復雜疾病遺傳特征的全局、系統(tǒng)的認識。
　　開展HBV-ACLF表型的全基

6、因組關聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)，解析其全基因組范圍內的宿主遺傳位點及遺傳關聯(lián)圖譜，有助于認識HBV-ACLF的驅動機制及干預靶點。因此，本課題在建立HBV-ACLF病例大樣本、多中心隊列的基礎上，對其臨床特征及炎癥因子譜進行了分析，開展了HBV-ACLF的全基因組關聯(lián)研究，并對主要關聯(lián)位點HLA-DR進行了精細解析和功能注釋，以及陽性關聯(lián)HLA等位對HBV變異的限制性分析。本研究結果

7、首次從全基因組角度明確了HBV-ACLF的主要遺傳位點，提示HLA-DR等位限制性CD4+T細胞途徑對HBV-ACLF的驅動作用。
　　本課題的主要研究結果如下：
　　1.共納入1300例HBV-ACLF患者和2087例HBV無癥狀攜帶者進入3-stage的全基因組關聯(lián)研究，樣本來自重慶、北京、泉州、遵義、南寧5個中心。所有患者均無抗病毒史、無既往肝炎發(fā)作或肝功能失代償病史。對1300例HBV-ACLF患者進行臨床特征分析，

8、LC-ACLF占60％左右，NLC-ACLF占40％;HBeAg陰性的HBV-ACLF占60％，HBeAg陰性并且HBV DNA＜104IU/mL的HBV-ACLF占17.1％。與LC-ACLF相比，NLC-ACLF患者表現(xiàn)為更年輕（平均年齡39.5vs.43.9歲，p=3.14×10-11）、更高的ALT水平（平均值1153vs.809IU/L，p=1.36×10-11）、腹水陽性率較低(58.7％vs.88.4％，p=9.25×10

9、-35)、起病后更短時間內INR達到1.5及發(fā)生腦病(平均值分別19.8vs.24.8天，p=1.36×10-11;27.3vs.38.1天，p=5.16×10-6)。
　　2.對1013份患者血清樣本進行35種細胞因子的多重定量檢測，結果顯示，國外酒精性肝硬化ACLF研究所關注的重要指標PCT（提示細菌感染）和CRP（提示肝外器官衰竭），在HBV-ACLF患者中其濃度低于普通慢性乙型肝炎(CHB)患者。與慢性乙型肝炎輕中度及重度

10、相比，HBV-ACLF患者顯著升高的細胞因子有6種：Th1型細胞因子IL-1a、TNF-β，Th2型細胞因子IL-5、IL-10和IL-13，Th17型細胞因子IL-17。
　　3.HBV-ACLF的GWAS初始階段分析顯示全基因組范圍內1、6、12號染色體有顯著的關聯(lián)信號(p＜1×10-5)，LC-ACLF和NLC-ACLF兩種亞型的共同遺傳關聯(lián)位點位于6號染色體HLA-Ⅱ區(qū)域。經(jīng)過replication1a和1b獨立樣本驗證表

11、明HLA-DR區(qū)域是主要關聯(lián)位點，再經(jīng)過replication2a和2b驗證，明確了rs3129859與HBV-ACLF顯著相關(Pcombine=7.40×10-19，OR=1.83)。
　　4.分層分析顯示rs3129859是HBV-ACLF的獨立風險因素，與慢性乙型肝炎活動狀態(tài)和HBV再活化無關。風險等位rs3129859*C與HBV-ACLF臨床進程相關，攜帶風險等位rs3129859*C的ACLF患者和S-CHB患者，在

12、入院28天時INR達到1.5及發(fā)生腹水的風險更高（分別有p=3.95×10-4，p=3.03×10-4）。在NLC-ACLF亞組，攜帶風險等位rs3129859*C的患者，28天死亡率更高(p=0.03)。
　　5.HLA-DRB1*1202等位是HBV-ACLF最顯著的風險等位(p=3.94×10-6，OR=2.05)。HLA-DRB1*1202的全球分布與HBV-ACLF地理流行病學趨勢一致，在中國(5.9-21.7％)和東南

13、亞地區(qū)(6.8-35.3％)等位頻率最高。
　　6.HLA-DRβ第28位氨基酸是最顯著的關聯(lián)氨基酸(p=3.03×10-6，OR=1.75)。其次，關聯(lián)的氨基酸還包括HLA-DRβ蛋白第26、30、32、37、38和85位氨基酸，以及HLA-DQα蛋白第40、47、50、51、53、56、69、76位氨基酸和HLA-DQβ蛋白第45位氨基酸(p＜0.001)。蛋白結構三維重建顯示這些關聯(lián)氨基酸位于HLA分子抗原結合溝槽內。

14、>　　7.等位單倍型rs3129859C-DRB1*1202-DQA1*0601-DQB1*0301和氨基酸單倍型DRβ-LEHHLLA-DQα-GCVLQdelTL-DQβ-E是風險單倍型，攜帶風險單倍型的HBV感染者，罹患ACLF的風險更高（additive model，分別p=1.16×10-4，OR=1.94;p=2.43×10-6，OR=2.10）。
　　8.生存分析提示風險等位及風險單倍型與HBV-ACLF臨床進程相關

15、。在非肝硬化ACLF亞組，攜帶風險單倍型rs3129859C-DRB1*1202-DQA1*0601-DQB1*0301的患者入院后28天(p=3.49×10-4)、90天(p=0.003)及180天(p=0.003)的死亡率更高，且肝性腦病發(fā)生率更高(p=0.019)，氨基酸單倍型也觀察到一致的相關性。
　　結論：
　　1.我們的數(shù)據(jù)對于認識HBV-ACLF的自然史有重要意義：相當比例的慢性HBV感染者可在無肝硬化基礎的情

16、況下發(fā)生ACLF;HBV自然史處于低復制期和e抗原陰性期的患者，發(fā)生ACLF的風險不容忽視;NLC-ACLF的疾病進展更為迅速，HBV-ACLF發(fā)病年齡（42歲）遠低于歐洲酒精性肝硬化ACLF患者（56歲）。
　　2.HBV-ACLF患者血清炎癥因子譜分析表明HBV-ACLF患者確實存在劇烈的SIRS和CARS并存局面。HBV-ACLF患者CD4Th細胞因子通路劇烈活化，有別于慢性乙型肝炎輕中度和重度，也不同于歐洲酒精性肝硬化AC

17、LF患者。
　　3.NLC-ACLF和LC-ACLF亞型具有共同的遺傳易感位點，亞型位點、定量性狀位點（肝酶、性激素等）與HBV-ACLF位點通路存在交互作用。
　　4.HLA-DR是HBV-ACLF的主要遺傳易感位點，風險等位rs3129859*C和HLA-DRB1*1202可作為HBV-ACLF臨床預警預后的marker。風險等位有特異限制的病毒變異位點，與肝炎活化、病毒正選擇和表位漂移有關。
　　總之，本研究首次