骨骼肌缺血再灌注后肺損傷的發(fā)生機(jī)理及其防護(hù)研究.pdf

1、背景與目的:
　　骨骼肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion,IR)損傷是臨床常見的病理生理過程,缺血部位的循環(huán)重新建立后,局部組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能損傷可能會進(jìn)一步加重,還將導(dǎo)致多種遠(yuǎn)隔臟器的損傷,甚至引起全身炎癥反應(yīng)綜合癥( systemic inflammatory response syndrome, SIRS)、器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome, M

2、ODS),危及患者生命。肺是最易受損的遠(yuǎn)隔器官之一,肺損傷是骨骼肌IR、下肢嚴(yán)重創(chuàng)傷的常見并發(fā)癥,嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)急性肺損傷( acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征( acute respiratory distress syndrome,ARDS),與危重患者的高病死率明顯相關(guān)。骨骼肌缺血再灌注后肺損傷的發(fā)生機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜,可能涉及炎癥反應(yīng)、水腫、氧化應(yīng)激、神經(jīng)體液因子的激活、免疫紊亂以及硫化氫(hydrogen

3、 sulfide, H2S)/胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)體系的下調(diào)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(rennin angiotensin aldosterone system,RAAS)的激活等多個(gè)環(huán)節(jié),共同作用導(dǎo)致肺功能的急劇減退。然而骨骼肌缺血再灌注后肺損傷的早期診斷及治療并不理想,其中的免疫炎性損傷、水代謝障礙機(jī)理,以及與H2S/CSE體系、RAAS的關(guān)系尚未明確,一直都是臨床及科研工作

4、研究的熱點(diǎn)。本研究通過:一、以我院雙側(cè)全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者為研究對象,聯(lián)合采用 Calra細(xì)胞分泌蛋白( Clara cell secretion protein, CC16)及腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor, TNFα)、白介素(Interleukin, IL)中IL-1β、IL-6、IL-8炎性因子水平作為肺損傷外周血標(biāo)記物,探討雙側(cè)全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后炎性損傷及肺泡-毛細(xì)血管膜受損在肺損傷過程的作用。二、在雙

5、膝關(guān)節(jié)置換術(shù)臨床觀察的基礎(chǔ)之上,建立大鼠后肢I(xiàn)R及復(fù)合創(chuàng)傷模型,模擬止血帶所致的缺血再灌注及雙膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中骨及軟組織的復(fù)合創(chuàng)傷的病理生理過程,觀察單純IR及復(fù)合創(chuàng)傷所致肺損傷的程度,及肺組織損傷標(biāo)記物CC16水平的差異,同時(shí)關(guān)注水通道蛋白1(Aquaporins1,AQP1)、水通道蛋白5(Aquaporin5, AQP5)及 TLR4(Toll-like receptors4)-髄樣分化初級反應(yīng)基因88(Myeloid differ

6、entiation primary-response gene88, MyD88)-核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)通路的表達(dá),進(jìn)一步探討骨骼肌缺血再灌注及復(fù)合創(chuàng)傷后肺組織免疫炎性反應(yīng)、肺組織水轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的機(jī)制。三、給予硫氫化鈉(sodium hydrosu lfide, NaHS)及炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine, PPG)干預(yù)肺組織內(nèi)源性H2S水平,或給予螺內(nèi)酯拮抗醛固酮(aldos

7、terone,Ald)受體,深入尋求缺血再灌注損傷過程中介導(dǎo)肺組織損傷的關(guān)鍵分子和信號通路,探索干預(yù)及治療肺損傷的可行、有效的靶點(diǎn)。
　　方法:
　　第一部分:
　　行雙膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)病人15例,以Elisa或Liminex觀察術(shù)前、術(shù)后4h、術(shù)后12h外周血肺泡-毛細(xì)血管膜損傷的特異性標(biāo)記物 CC16及TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8炎性損傷標(biāo)記物變化。第二部分:雄性Wistar大鼠22只,制備大鼠雙側(cè)后肢I(xiàn)

8、R模型及后肢復(fù)合創(chuàng)傷模型,隨機(jī)分為3組,即①正常對照組(n=8);②IR組(n=8);③復(fù)合創(chuàng)傷組(n=6)。觀察肺組織HE染色及電鏡結(jié)果、以Real-time PCR法檢測肺組織CC16mRNA表達(dá)來評估肺損傷程度;計(jì)算肺組織濕/干重比值,采用免疫組化、Real-time PCR方法 Western-blot、Real-time PCR方法檢測肺組織AQP1、AQP5的表達(dá),評價(jià)肺水腫的形成,探討水轉(zhuǎn)運(yùn)障礙機(jī)制;以類似方法檢測TLR4

9、-Myd88-NF-κB通路mRNA及蛋白水平的變化,探究肺組織免疫炎性損傷機(jī)制。第三部分:雄性Wistar大鼠40只,制備大鼠雙側(cè)后肢I(xiàn)R模型,隨機(jī)分為5組,每組8只,即①正常對照組;②IR組;③IR+NaHS組:IR模型制作前腹腔注射NaHS0.78mg/kg;④IR+PPG組:IR模型制作前腹腔注射PPG60mg/kg;⑤IR+螺內(nèi)酯組:IR模型制作前每天予螺內(nèi)酯20mg/kg灌胃,共持續(xù)6天,評價(jià)肺損傷及肺水腫程度,采用免疫組化

10、、Real-time PCR,以及 Western-blot方法檢測肺組織 AQP1、AQP5的表達(dá),以及TLR4-Myd88-NF-κB通路mRNA及蛋白水平的變化,探討可行的干預(yù)措施及調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　第一部分:
　?、匐p側(cè)膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后4小時(shí)患者血清CC16水平較術(shù)前明顯升高(P<0.05),約是術(shù)前的2倍,術(shù)后12小時(shí)與正常組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　?、谛g(shù)后4小時(shí)血清 TNF-

11、α、IL-6、IL-8濃度較術(shù)前明顯升高(P<0.05),12小時(shí)后TNF-α恢復(fù)正常(與術(shù)前比較P>0.05),IL-8水平下降但仍然高于術(shù)前水平(P<0.05),IL-6水平較術(shù)后4小時(shí)繼續(xù)上升(P<0.05)。術(shù)后IL-1β水平較術(shù)前比較無明顯差異(P>0.05)。
　　第二部分:
　?、倥c正常組比較,IR組大鼠出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤、肺泡隔增寬、肺水腫形成,肺組織 CC16mRNA水平減低( P<0.05),復(fù)合創(chuàng)傷組大鼠

12、肺組織炎細(xì)胞浸潤及肺損傷程度進(jìn)一步加重, CC16mRNA水平減低更為明顯(與IR組比較,P<0.05),標(biāo)志著肺泡上皮損傷加重。
　?、谂c正常組比較,缺血再灌注組大鼠肺組織濕/干重比增加(P<0.05),肺組織出現(xiàn)水腫,肺組織 AQP1、AQP5mRNA及蛋白水平減低(P<0.05),復(fù)合創(chuàng)傷組肺濕干重增加更為明顯(與IR組比較,P<0.05),AQP1、AQP5的表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)(與IR組比較,P<0.05),肺水轉(zhuǎn)運(yùn)障礙及肺水

13、腫程度加重。
　?、叟c正常組比較,IR組TLR4及MyD88的mRNA水平增加(P<0.05),TLR4及p-NF-κB p65的蛋白合成增加(P<0.05),這些變化在復(fù)合創(chuàng)傷組更為明顯(P<0.05)。
　　第三部分:
　?、倥cIR組比較,IR+NaHS組及IR+螺內(nèi)酯組大鼠肺損傷減輕,肺組織CC16 mRNA水平增加(P<0.05),IR+PPG組肺組織損傷及水腫程度加重,CC16 mRNA的合成更加減少(P<0

14、.05)。
　?、谂cIR組比較,IR+NaHS組肺濕/干重比下降(P<0.05),肺AQP1及AQP5蛋白及mRNA水平上調(diào)(P<0.05);IR+螺內(nèi)酯組肺濕/干重比下降(P<0.05),AQP5蛋白及mRNA水平、AQP1 mRNA水平增加(P<0.05),AQP1蛋白水平無明顯變化(P>0.05);IR+PPG組后肺濕/干重比升高P<0.05),AQP1蛋白及 mRNA水平、AQP5 mRNA水平下降(P<0.05),AQP

15、5蛋白水平無改變(P>0.05)。
　?、叟cIR組比較,IR+NaHS組及IR+螺內(nèi)酯大鼠肺TLR4、p-NF-κB p65的蛋白表達(dá)及TLR4、MyD88 mRNA水平明顯減低(P<0.05),IR+PPG組大鼠較IR組進(jìn)一步增加(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.雙側(cè)全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后早期患者外周血CC16、TNF-α、IL-6及IL-8水平明顯升高,標(biāo)志著雙側(cè)全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)術(shù)后早期即出現(xiàn)肺泡-毛細(xì)血管膜的損傷及

16、炎性反應(yīng)的激活,提示著肺炎性損傷的發(fā)生。
　　2.骨骼肌缺血再灌注可導(dǎo)致肺組織水腫、炎性細(xì)胞浸潤及損傷,復(fù)合創(chuàng)傷可使肺組織的損傷水腫程度進(jìn)一步加重。
　　3.骨骼肌缺血再灌注后肺組織AQP1、AQP5表達(dá)降低,TLR4-Myd88-NF-κB通路激活,大鼠后肢復(fù)合創(chuàng)傷可使 AQP1、AQP5、TLR4-Myd88-NF-κB通路的變化更為明顯,導(dǎo)致肺組織水轉(zhuǎn)運(yùn)障礙免疫炎性損傷,是骨骼肌缺血再灌注及創(chuàng)傷后肺損傷的重要環(huán)節(jié)。