大蒜素通過抑制凋亡通路減少順鉑誘導(dǎo)的耳毒性研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 大蒜素通過抑制凋亡通路減少順鉑誘導(dǎo)的聽力損失
　　目的:利用C57小鼠腹腔注射順鉑制造藥物性聽力損失模型，用順鉑聯(lián)合大蒜素腹腔注射來探討大蒜素在體內(nèi)對順鉑誘導(dǎo)的聽力損失是否具有保護作用。
　　方法:體內(nèi)實驗所用C57小鼠性別匹配，年齡在7-8周，體重17-23g。小鼠被隨機分為三組，每組30只;第1組，0.9％生理鹽水注射為對照組;第2組，順鉑注射;第3組，順鉑+大蒜素注射

2、。第1組小鼠給予連續(xù)七天腹腔注射0.9％生理鹽水（0.6毫升/100克）。第2組小鼠給予連續(xù)七天腹腔注射順鉑(3毫克/公斤)。第3組小鼠在順鉑注射前一天腹腔注射大蒜素（18.2毫克/公斤），在接下來的連續(xù)七天先腹腔注射大蒜素，2小時之后再腹腔注射順鉑（3毫克/公斤），用藥前和用藥后檢測三組小鼠的聽性腦干反應(yīng)(ABR)，TUNEL凋亡試劑盒檢測三組小鼠耳蝸外毛細胞、支持細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的凋亡情況。對三組小鼠耳蝸中剩余的外毛細胞和螺旋

3、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元進行計數(shù)，用透射電鏡觀察外毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中線粒體情況，用Western blot檢測三組耳蝸組織中Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3的表達情況，免疫熒光檢測三組小鼠耳蝸外毛細胞中P53的表達和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中細胞色素-C、cleaved-caspase-9及cleaved-caspase-3的表達情況，檢測三組小鼠耳蝸組織中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(

4、SOD)水平。
　　結(jié)果:ABR結(jié)果表明，C57小鼠單獨腹腔注射順鉑組表現(xiàn)出聽覺腦干反應(yīng)的閾值增加，而大蒜素+順鉑組小鼠的聽覺功能的大部分頻率受到保護。順鉑引起耳蝸外毛細胞及底轉(zhuǎn)、中轉(zhuǎn)的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元計數(shù)減少，大蒜素能保護順鉑引起的耳蝸外毛細胞及耳蝸中轉(zhuǎn)的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷。TUNEL檢測結(jié)果顯示:順鉑引起耳蝸外毛細胞、支持細胞及耳蝸底轉(zhuǎn)和中轉(zhuǎn)螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元凋亡，大蒜素能明顯地減少順鉑誘導(dǎo)的凋亡情況。透射電鏡結(jié)果顯示:大蒜素

5、能顯著地降少順鉑誘導(dǎo)的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中線粒體的損傷。Western blot結(jié)果顯示:順鉑增加耳蝸組織中Bax、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3的表達，降低Bcl-2的表達;大蒜素能顯著地降低耳蝸組織中Bax、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3的表達，增加Bcl-2的表達。免疫熒光結(jié)果顯示:順鉑誘導(dǎo)螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中細胞色素C的釋放、cleaved-caspas

6、e-9和cleaved-caspase-3的表達增強，誘導(dǎo)外毛細胞、支持細胞中P53的表達增強，大蒜素能顯著地減少螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中細胞色素C的釋放，cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3的表達，減少耳蝸中轉(zhuǎn)、底轉(zhuǎn)外毛細胞中P-53的表達及耳蝸中轉(zhuǎn)支持細胞中P53的表達。此外，大蒜素能降低耳蝸組織中丙二醛水平，升高耳蝸組織中超氧化物歧化酶的水平。
　　結(jié)論:大蒜素可有效地預(yù)防順鉑誘導(dǎo)的聽力損失，其中

7、大蒜素通過線粒體途徑保護順鉑誘導(dǎo)的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的凋亡，通過p53途徑來保護耳蝸外毛細胞和支持細胞的凋亡。同時大蒜素通過抗氧化作用保護順鉑誘導(dǎo)的耳蝸損傷。
　　第二部分 大蒜素通過抑制凋亡通路減少順鉑誘導(dǎo)的前庭毒性
　　目的:本研究的目的是探討大蒜素對順鉑誘導(dǎo)的小鼠前庭功能障礙的保護，并探討大蒜素對順鉑誘導(dǎo)的耳前庭毒性的保護作用機理。
　　方法:本實驗所用C57小鼠性別匹配，年齡在7-8周，體重17-23 g。小鼠被

8、隨機分為三組，每組10只;第1組，0.9％生理鹽水注射為對照組;第2組，順鉑注射;第3組，順鉑+大蒜素注射。第1組小鼠給予連續(xù)七天腹腔注射0.9％生理鹽水（0.6毫升/100克）。第2組小鼠給予連續(xù)七天腹腔注射順鉑(3毫克/公斤)。第3組小鼠在順鉑注射前一天腹腔注射大蒜素（18.2毫克/公斤），在接下來的連續(xù)七天先腹腔注射大蒜素，2小時之后再腹腔注射順鉑（3毫克/公斤），用藥前后都用游泳實驗來觀察小鼠的泳姿情況。游泳測試設(shè)備為盛有溫水的

9、矩形水箱，長70厘米，寬40厘米，深10厘米，小鼠被放置在水箱的中心和身體與水箱的長軸平行，放手，觀察小鼠自由游泳的姿勢。小鼠以穩(wěn)定的姿勢游泳，頭露出水面，評分為3分。小鼠頭露出水面，游泳姿勢不穩(wěn)，評分為2分。小鼠的頭部不能向上或不能露出水面，評分為0分，這只小鼠必須立即從水中被救出，以免被淹死。每組隨機抽取5只小鼠進行游泳試驗，每只小鼠進行3次試驗，每次1分鐘，每次間隔10分鐘。交替試驗，防止過度疲勞影響試驗結(jié)果。計算游泳得分平均數(shù)進

10、行統(tǒng)計分析。測試是在室溫下進行的。用免疫熒光方法觀察三組實驗中小鼠橢圓囊、球囊、壺腹毛細胞纖毛束的外觀和密度。用TUNEL試劑盒檢測三組實驗中小鼠橢圓囊、球囊、壺腹毛細胞的凋亡情況。用免疫熒光方法檢測三組中小鼠橢圓囊、球囊、壺腹毛細胞層和血管層細胞質(zhì)中cleaved-caspase-3的表達情況及熒光密度，用免疫熒光方法檢測三組實驗中小鼠橢圓囊、球囊、壺腹毛細胞層和血管層細胞核中AIF的表達情況及AIF核轉(zhuǎn)移率。
　　結(jié)果:游泳實

11、驗結(jié)果表明，C57小鼠單獨腹腔注射順鉑組表現(xiàn)出前庭功能受損，而大蒜素+順鉑組中大蒜素能顯著地保護小鼠的前庭功能。注射順鉑7天后，順鉑組的橢圓囊、球囊和壺腹毛細胞的纖毛束數(shù)量明顯減少，纖毛束分布不均和外觀不正常，然而，順鉑+大蒜素組橢圓囊、球囊和壺腹毛細胞的纖毛束保存較好、外觀正常和高密度分布。TUNEL檢測凋亡情況:對照組沒有發(fā)現(xiàn)TUNEL染色，在順鉑組的前庭神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元、間質(zhì)細胞、橢圓囊、球囊、壺腹中毛細胞和支持細胞中發(fā)現(xiàn)了TUNEL

12、陽性染色。然而，在順鉑+大蒜素治療組的前庭神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元、毛細胞和支持細胞中都沒有發(fā)現(xiàn)TUNEL染色，只有一些間質(zhì)細胞被TUNEL染色標記。免疫熒光檢測cleaved-caspase-3結(jié)果:在對照組中，沒有發(fā)現(xiàn)cleaved-caspase-3染色。在順鉑治療組中前庭毛細胞層和血管層細胞的細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)cleaved-caspase-3陽性染色。在順鉑+大蒜素組中，前庭毛細胞和血管層細胞的細胞質(zhì)中cleaved-caspase-3的表達明

13、顯減少。在順鉑組的前庭毛細胞層和血管層細胞cleaved-caspase-3的熒光密度明顯高于對照組，而在順鉑+大蒜素組，大蒜素顯著地降低了前庭毛細胞層和血管層細胞cleaved-caspase-3的熒光密度。免疫熒光檢測AIF的表達情況:在對照組中，AIF在前庭毛細胞層和血管層細胞質(zhì)中分布，在細胞核內(nèi)沒有分布。經(jīng)過7天的順鉑治療，在前庭毛細胞層和血管層細胞的核區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了強烈的AIF熒光。前庭毛細胞層和血管層細胞中AIF核轉(zhuǎn)移率在順鉑

14、組明顯高于對照組;在順鉑+大蒜素組，大蒜素顯著地降低毛細胞層AIF核轉(zhuǎn)移率，但是大蒜素沒有顯著地降低血管層細胞AIF核轉(zhuǎn)移率。
　　結(jié)論:腹腔注射順鉑的小鼠，在游泳測試中表現(xiàn)出前庭功能障礙，這結(jié)果表明小鼠的前庭受損。然而，在大蒜素預(yù)處理組，大蒜素可以明顯地阻止了這些損傷。大蒜素顯著地減少順鉑誘導(dǎo)的橢圓囊、球囊、壺腹的毛細胞層和血管層細胞中cleaved-caspase-3的表達，也減少了橢圓囊、球囊、壺腹的毛細胞層中AIF的核轉(zhuǎn)位