抗HLA抗體對異基因造干細(xì)胞移植預(yù)后的影響及其機制研究.pdf

1、第一部分動態(tài)檢測抗HLA抗體及分析DP位點錯配對HLA-12/12全相合非血緣異基因造血干細(xì)胞移植預(yù)后的影響
　　目的：分析抗人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)抗體和HLA-DP位點錯配對惡性血液病患者HLA- A, B, C, DRB1, DQB1, DQA1(HLA-12/12)全相合非血緣供體異基因造血干細(xì)胞移植(matched unrelated donor hematopoieti

2、c stem cell transplantation, MUD-HSCT)預(yù)后的影響，推動移植前抗體篩查--供體選擇--預(yù)后評估--干預(yù)治療--移植后隨訪臨床體系的建立，并改善惡性血液病患者的預(yù)后。
　　方法：選擇2011年10月至2014年3月期間行HLA-12/12 MUD-HSCT的123例惡性血液病患者為研究對象，通過基因測序(SBT)和寡核苷酸探針雜交(SSOP)以及特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)(High.Res SSP)的

3、方法，對供受者的外周血標(biāo)本進(jìn)行HLA-A, B, C, DRB1, DQA1, DQB1, DPA1, DPB1高分辨基因分型檢測；采用流式液相芯片技術(shù)(Luminex)對123例移植前、117例移植后1個月和106例移植后3個月血清樣本進(jìn)行抗HLA抗體的初篩和特異性抗體檢測。以平均熒光強度(mean fluorescence intensity, MFI)值判斷抗體的結(jié)果：MFI﹤500為陰性，500-1000為可疑陽性，1000-2

4、000為陽性，2000-5000為中等陽性，﹥5000為強陽性。同時結(jié)合臨床預(yù)后指標(biāo)，分析抗HLA抗體及DP位點錯配對移植預(yù)后的影響。
　　結(jié)果：123例患者的2年總生存率(OS)為73.2％，2年無病生存率(DFS)為69.1%。AML/MDS、ALL和CML患者的2年OS分別為56.4%、65.7%和88.9%(P=0.275)，2年DFS分別為53.1%、58.2%和88.9%(P=0.217)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

5、　　患者在移植前、移植后1個月和3個月抗 HLA抗體的檢出率分別為37.4%(46/123)、40.2%(47/117)、22.6%(24/106)，其中移植前預(yù)存抗供者特異性HLA抗體(donor-special anti-HLA antibodies, DSA)比例為4.9%(6/123)。移植后1和3個月的抗體陽性率變化在預(yù)存抗HLA抗體陰性組(30.7%vs.15.1%)和陽性組(57.1%vs.35.0%)均有統(tǒng)計學(xué)差異，P值

6、為0.03和0.044。交叉比較預(yù)存抗HLA抗體陰性組和陽性組移植后1個月(30.7%vs.57.1%)和3個月(15.1%vs.35.0%)抗體陽性率，均有統(tǒng)計學(xué)意義，P值為0.005和0.018。
　　移植前預(yù)存抗 HLA抗體陽性組患者與陰性組患者在巨核系造血重建(14d vs.13d)、II-IV度aGVHD發(fā)生率(43.3%vs.20.4%)、OS(50.2%vs.65.7%)等方面差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，P值分別為0.033

7、、0.006、0.029，而復(fù)發(fā)(29.8% vs.17.5%, P=0.125)和治療相關(guān)性死亡率(TRM)(33.1%vs.15.8%, P=0.224)在兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異。在69例AML/MDS患者中，預(yù)存抗HLA抗體陽性組對與生存率的影響更顯著，與陰性組相比2年OS為35.3%和74.3%(P=0.006)，DFS為36.3%和68.3%(P=0.025)。
　　動態(tài)隨訪移植后1個月時，抗HLA抗體持續(xù)陰性組、陰性轉(zhuǎn)陽性

8、組、持續(xù)陽性組和陽性轉(zhuǎn)陰性組的II-IV度 aGVHD發(fā)生率為21.2%、17.4%、33.3%和55.6%(P=0.02)，OS為84.6%、73.9%、62.5%、61.1%(P=0.082)，DFS為78.8%、69.6%、58.3%、61.1%(P=0.24)。移植后3個月時，抗HLA抗體持續(xù)陰性組、陰性轉(zhuǎn)陽性組、持續(xù)陽性組和陽性轉(zhuǎn)陰性組的II-IV度 aGVHD發(fā)生率為23.4%、11.1%、35.7%和55.6%(P=0.0

9、5)，OS為83.0%、88.9%、64.3%和61.1%(P=0.15)，DFS為78.8%、77.8%、57.1%和61.1%(P=0.29)，TRM為10.6%、11.1%、14.3%和5.6%(P=0.81)。
　　預(yù)存抗 HLA抗體陽性組患者 cGVHD的發(fā)生率高于預(yù)存抗體陰性組(52.4% vs.32.4%, P=0.036)。比較兩組患者廣泛性cGVHD的發(fā)生率，同樣有統(tǒng)計學(xué)差異(9.9%vs.3.8%, P=0.0

10、45)。動態(tài)隨訪移植后抗體的變化，cGVHD的發(fā)生率在持續(xù)陰性組為32.6%，高于持續(xù)陽性組61.5%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.061)。
　　供患者HLA-DP位點錯配比例為83.6%(92/110)，其中HLA-DPB1和DPA1位點均不合占62.7%(69/92)，HLA-DPB1位點不合占16.4%(18/92)，HLA-DPA1位點不合占4.5%(5/92)。HLA-DP位點相合組和錯配組患者移植后II-IV度aGVH

11、D發(fā)生率分別為24.6%和32.3%(P=0.610)，OS分別為43.2%和34.2%(P=0.778)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。在預(yù)存抗HLA抗體陰性患者中，HLA-DP位點錯配組患者的OS和復(fù)發(fā)率為59.5%和12.8%，低于相合組80.8%(P=0.575)和18.2%(P=0.639)，差異有改變趨勢。
　　多因素分析提示移植前預(yù)存抗 HLA抗體陽性與 aGVHD(HR=2.876,95% CI1.106-7.475)、cG

12、VHD(HR=4.062,95% CI1.580-10.440)、OS(HR=2.199,95% CI1.037-4.661)均有顯著相關(guān)性，P值分別為0.03、0.004、0.04?；颊呒膊∥ｋU分層屬于高危組是OS( HR=2.391,95% CI1.112-5.139)和DFS( HR=2.397,95% CI1.172-4.903)的危險因素，P值為0.026和0.017。而CD34+細(xì)胞輸注數(shù)量達(dá)4*106/kg以上( HR=4

13、.908,95%CI1.743-13.824)和ABO血型不合(HR=3.120,95%CI1.153-8.444)也是發(fā)生aGVHD的另一危險因素，P值為0.003和0.026。
　　結(jié)論：動態(tài)檢測移植前后抗HLA抗體變化是判斷HLA-12/12 MUD-HSCT預(yù)后的重要參考指標(biāo)，且抗HLA抗體陽性獨立于HLA-DP位點錯配影響移植患者的預(yù)后。因此，對移植前預(yù)存抗HLA抗體患者采取相應(yīng)干預(yù)治療措施有望減少移植后并發(fā)癥，并改善患

14、者的生存狀況。
　　第二部分體外研究抗供者特異性HLA抗體引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機制
　　目的：建立抗供者特異性HLA抗體(DSA)的體外實驗?zāi)Ｐ?，探討DSA是否影響PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路中的增殖和抗凋亡通路，闡明內(nèi)皮細(xì)胞的增殖是引起內(nèi)皮細(xì)胞功能受損的重要因素，為DSA影響allo-HSCT預(yù)后提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法：在DSA與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial

15、 cells, HUVEC)共培養(yǎng)的模型中，選擇HLA高分辨基因分型為A*02:01,03:01 B*15:15,35:03 C*01:02,04:01的HUVEC-I和為A*24:02,68:03 B*51:01,51:01 C*14:02,15:02的HUVEC-II為研究對象，相對應(yīng)的DSA分別為抗HLA-A2、B35、Cw1、A9(A23/A24)、Bw4(B51/B53)抗體。同時，應(yīng)用Luminex方法檢測倍比稀釋后不同濃度

16、DSA的MFI值定為陽性組、中等陽性組、強陽性組和強強陽性組，以IgG為對照組。在內(nèi)皮細(xì)胞饑餓培養(yǎng)6小時后與上述不同MFI水平DSA共培養(yǎng)15min，冰上裂解細(xì)胞30min，抽提蛋白并測定蛋白濃度。采用Western Blot方法檢測PI3K/AKT信號通路中蛋白FAK-Tyr576/577、PDK1-Ser241、AKT-Thr308、AKT-Ser473、p70S6K-Thr421/Ser424、S6RP-Ser235/236磷酸化

17、和總蛋白的表達(dá)水平，及蛋白Bcl-2和β-actin的表達(dá)。同時選擇終濃度為0.01μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml、10.0μg/ml的DSA與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)15min進(jìn)行上述相同的實驗。
　　結(jié)果：
　　1．DSA濃度和MFI值的相關(guān)性
　　抗HLA-A2、A24、B51抗體濃度分別為0.01μg/ml、0.011μg/ml、0.094μg/ml時，其MFI值在2000左右為陽性水平；為0.031μg

18、/ml、0.023μg/ml、0.25μg/ml時，其MFI值在7000左右為中等陽性；為0.077μg/ml、0.05μg/ml、0.75μg/ml時，其MFI值10000左右為強陽性水平；為0.153μg/ml、0.5μg/ml、1.5μg/ml時，其MFI值在14000-20000為強強陽性水平。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著抗體濃度的增加，MFI值升高；超過一定濃度后，MFI值不再繼續(xù)上升呈現(xiàn)飽和趨勢，即抗體表達(dá)量達(dá)到平臺期。故體外抗H

19、LA抗體和HLA抗原結(jié)合的曲線呈現(xiàn)逐漸上升型變化。
　　2. DSA激活內(nèi)皮細(xì)胞PI3K/AKT增殖和抗凋亡信號通路
　　2.1抗HLA-A位點抗體刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和抗凋亡蛋白磷酸化表達(dá)
　　不同MFI值的抗HLA-A2抗體與HUVEC-1共培養(yǎng)15min，特異性抗原抗體結(jié)合后，使PI3K/AKT信號通路上游蛋白PDK1在Ser241位點磷酸化活化。繼信號通路上游蛋白磷酸化活化后，增殖通路蛋白AKT-Thr308、p7

20、0S6K-Thr421/Ser424、S6RP-Ser235/236也磷酸化活化，它們的磷酸化表達(dá)量在對照組、陽性組、中等陽性組、強陽性組、強強陽性組分別為54%、73%、100%、62%、37%；55%、72%、94%、100%、50%；51%、65%、68%、100%、82%(P﹤0.001)，當(dāng)抗體MFI值為中等陽性和強陽性時，它們的磷酸化表達(dá)量最大。同時，抗凋亡通路中間蛋白AKT-Ser473和終末蛋白Bcl-2表達(dá)，其表達(dá)量在

21、對照組、陽性組、中等陽性組、強陽性組、強強陽性組分別為41%、31%、32%、100%、56%和39%、58%、100%、97%、60%(P﹤0.001)，當(dāng)抗體MFI值為中等陽性和強陽性時，其磷酸化表達(dá)量最高。
　　當(dāng)不同濃度的抗HLA-A2抗體與HUVEC-1共培養(yǎng)15min后，同樣可誘導(dǎo)上游蛋白FAK-Tyr576/577和PDK1-Ser241磷酸化活化。繼而，增殖通路中間蛋白AKT-Thr308磷酸化活化，其表達(dá)量在對照

22、組、0.01μg/ml組、0.1μg/ml組、1.0μg/ml組、10μg/ml組分別為87%、94%、97%、94%、100%，活化后的AKT蛋白進(jìn)一步激活其下游因子p70S6K-Thr421/Ser424和增殖通路終末蛋白S6RP-Ser235/236，二者的表達(dá)量在不同組分別為62%、88%、92%、88%、100%和34%、42%、60%、64%、100%(P﹤0.001)，表達(dá)量隨著濃度的增加而增強。同時，抗凋亡通路也被激活，

23、AKT-Ser473的表達(dá)量在不同組分別為54%、8%、25%、84%、100%；抗凋亡通路終末蛋白Bcl-2的表達(dá)量在不同組分別為80%、79%、84%、100%、91%(P﹤0.001)。因此，不論是不同MFI值或是不同濃度的抗HLA-A2抗體均可激活PI3K/AKT信號通路，誘導(dǎo)增殖和抗凋亡蛋白表達(dá)，并呈現(xiàn)一定強度和濃度差異性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖和抗凋亡。
　　當(dāng)終濃度分別為0.005μg/ml、0.01μg/ml、0.0

24、5μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的抗HLA-A24抗體與HUVEC-2共培養(yǎng)15min后，PI3K/AKT信號通路終末蛋白S6RP-Ser235/236的磷酸化表達(dá)量在對照組及不同濃度組分別為76%、95%、100%、90%、93%、88%、90%、94%、93%，其磷酸化表達(dá)量水平均較高，但是無明顯改變趨勢。這可能是由于HLA-A24和23抗體是A9的分解產(chǎn)物，抗A23和A2

25、4抗體可識別相同的抗原表位所致。
　　2.2抗HLA-B位點抗體使增殖通路終末蛋白S6RP在Ser235/236位點磷酸化
　　不同濃度抗HLA-B35抗體與HUVEC-1共培養(yǎng)15min，PI3K/AKT增殖通路終末蛋白S6RP磷酸化活化，其磷酸化表達(dá)量在對照組、0.01μg/ml組、0.1μg/ml組、1.0μg/ml組、10μg/ml組分別為70%、36%、100%、85%、96%，當(dāng)抗體濃度達(dá)到0.1μg/ml以上時

26、，磷酸化表達(dá)有所增強，但趨勢不明顯。
　　抗HLA-B51抗體與HUVEC-2共培養(yǎng)15min，在對照組、0.01μg/ml組、0.1μg/ml組、1.0μg/ml組、10μg/ml組S6RP磷酸化表達(dá)量分別為91%、98%、100%、90%、99%。增加DSA抗體濃度，其磷酸化表達(dá)量在對照組、1μg/ml組、5μg/ml組、10μg/ml組、15μg/ml組、30μg/ml組、45μg/ml組分別為89%、88%、98%、92%

27、、96%、100%、97%，其表達(dá)均無差異性。因此，不論是低濃度還是高濃度的抗HLA-B35抗體和B51抗體與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)之后，蛋白S6RP磷酸化趨勢表達(dá)均不明顯，考慮這可能是因為HLA-I類分子中存在抗原強弱表達(dá)的不同，HLA-B位點抗原性弱于A和C位點。
　　2.3抗HLA-Cw1抗體誘導(dǎo)增殖通路終末蛋白S6RP-Ser235/236磷酸化
　　抗HLA-Cw1抗體與HUVEC-1共培養(yǎng)15min，抗原抗體結(jié)合誘導(dǎo)PI

28、3K/AKT增殖通路終末蛋白S6RP-Ser235/236磷酸化，其表達(dá)量在對照組、0.01μg/ml組、0.1μg/ml組、1.0μg/ml組、10μg/ml組分別為37%、44%、88%、97%、100%(P﹤0.001)，磷酸化表達(dá)量隨著抗體濃度的增加而增強。故不同濃度抗 HLA-Cw1抗體也可激活PI3K/AKT增殖通路，刺激增殖終末蛋白表達(dá)并呈現(xiàn)濃度依賴性，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論：成功建立了DSA的體外實驗?zāi)Ｐ停?/p>