凝血因子Ⅶ啟動(dòng)子區(qū)甲基化調(diào)控基因表達(dá)及與顱腦創(chuàng)傷后進(jìn)展性出血性損傷相關(guān)性研究.pdf

1、本課題分三部分，第一部分從臨床角度闡述單純性顱腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）患者血漿凝血因子VII活性（coagulation factor VII activity，CFVIIa）水平與顱內(nèi)進(jìn)展性出血性損傷（progressive hemorrhagic injury，PHI）的相關(guān)性；第二和第三部分分別從細(xì)胞和臨床角度研究凝血因子VII（coagulation factor VII，CFVII）啟動(dòng)子

2、區(qū)甲基化對(duì)CFVII基因表達(dá)調(diào)控作用及與PHI的相關(guān)性。各部分研究摘要如下：
　　第一部分單純性顱腦創(chuàng)傷患者血漿凝血因子VII活性水平與顱內(nèi)進(jìn)展性出血性損傷的相關(guān)性
　　目的：研究單純性TBI患者血漿CFVIIa水平與PHI的相關(guān)性。
　　方法：根據(jù)研究納入和排除標(biāo)準(zhǔn)選取2010年8月至2014年6月在上海華山醫(yī)院神經(jīng)創(chuàng)傷中心急診入院的年齡≥17歲的中重度單純性TBI患者112例，采集患者入院時(shí)外周靜脈血標(biāo)本并送檢國(guó)際

3、標(biāo)準(zhǔn)化比值（international normalized ratio，INR）、活化部分凝血活酶時(shí)間（activeated partial thromboplasting time，APTT）、血小板（platelet，PLT）、D-二聚體、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）及CFVIIa。每24 h隨訪患者頭顱CT一次，當(dāng)再次CT掃描較首次CT掃描顯示的出血性病灶擴(kuò)大或有新出現(xiàn)的出血性病灶時(shí)被診斷為PHI。
　　結(jié)果

4、：PHI組患者血漿CFVIIa及PLT水平均顯著低于非PHI組（77.79％±22.82%VS100.32%±30.39%；126.95±48.46 VS148.13±53.41；P<0.05）；PHI組患者血漿APTT、INR、D-二聚體、FIB均高于非PHI組，但兩組之間差異不明顯（P>0.05）。Logistic回歸分析，結(jié)果顯示血漿CFVIIa低下（OR=1.06，95% CI=1.03～1.10，P<0.001）及PLT水平降

5、低（OR=1.01，95%CI=1.00～1.02，P=0.009）是單純性TBI患者發(fā)生PHI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　結(jié)論：?jiǎn)渭冃訲BI后PHI患者血漿CFVIIa及PLT水平均顯著低于非PHI患者，血漿CFVIIa低下及PLT水平降低是單純性TBI患者發(fā)生PHI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　第二部分凝血因子VII啟動(dòng)子區(qū)甲基化調(diào)控凝血因子VII表達(dá)
　　目的：研究CFVII基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化對(duì)CFVII表達(dá)調(diào)控作用。

6、　　方法：基因合成CFVII啟動(dòng)子區(qū)-781--1bp及-1000--1 bp兩條片段，并將上述片段亞克隆至PGL3-basic載體，獲得重組質(zhì)粒PGL3-F7UM-781--1、PGL3-F7UM-1000--1。酶切、測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤后，用甲基化轉(zhuǎn)移酶（M.SssI，NEB）對(duì)重組質(zhì)粒、PGL3-Basic、PGL3-Control質(zhì)粒進(jìn)行全甲基化修飾得到甲基化質(zhì)粒。本實(shí)驗(yàn)共分9組，分別為無(wú)轉(zhuǎn)染對(duì)照、PGL3-Basic（UM）、PGL

7、3-Basic（M）、PGL3-Control（UM）、PGL3-Control（M）、PGL3-F7UM-781--1、PGL3-F7M-781--1、PGL3-F7UM-1000--1、PGL3-F7M-1000--1。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑分別將以上質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒PRL-TK轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞（HepG2），檢測(cè)熒光素酶活性。
　　結(jié)果：各組甲基化質(zhì)粒較未甲基化質(zhì)粒熒光素酶表達(dá)水平均顯著降低（P<0.001）。其中PGL3-F7M

8、-781--1組熒光素酶表達(dá)較PGL3-F7UM-781--1組下降了約110倍（P<0.001）；而PGL3-F7M-1000--1組較PGL3-F7UM-1000--1組熒光素酶表達(dá)下降約244倍（P<0.001）。兩組非甲基化重組質(zhì)粒熒光素酶表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P=0.28）；而兩組甲基化重組質(zhì)粒熒光素酶表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。
　　結(jié)論：CFVII啟動(dòng)子區(qū)甲基化影響 CFVII基因表達(dá)，啟動(dòng)子區(qū)高甲基化

9、將導(dǎo)致CFVII基因表達(dá)降低。位于啟動(dòng)子區(qū)-781 bp至-1000 bp之間的CpG甲基化對(duì)CFVII基因表達(dá)影響更顯著。
　　第三部分單純性顱腦創(chuàng)傷患者血漿凝血因子VII啟動(dòng)子區(qū)甲基化與凝血因子VII活性水平及顱內(nèi)進(jìn)展性出血性損傷相關(guān)性研究
　　目的：研究單純性TBI患者血漿CFVII啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與血漿CFVIIa水平之間關(guān)系，并探討CFVII啟動(dòng)子區(qū)甲基化與PHI的相關(guān)性。
　　方法：選取符合條件的中重度單

10、純性TBI患者79例，采集患者入院時(shí)外周靜脈血，并送檢CFVIIa、PLT、APTT、INR、FIB、D-二聚體。提取患者血液基因組DNA，并對(duì)其進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理，設(shè)計(jì)合成引物，PCR擴(kuò)增目的基因片段，采用Sequenom質(zhì)譜法檢測(cè)患者 CFVII啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平。本實(shí)驗(yàn)共采用兩種分組方法：CFVIIa≥90%組與CFVIIa<90%組，PHI組與非PHI組。PHI定義與前述相同。
　　結(jié)果：采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)對(duì)所研究的FVI

11、I啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：CFVIIa≥90%組與CFVIIa<90%組患者CpG3位點(diǎn)甲基化率有顯著性差異（0.83±0.05 VS0.85±0.03，P<0.05），CFVIIa≥90%組患者CpG3位點(diǎn)甲基化率小于CFVIIa<90%組；而兩組患者CpG2、CpG4、CpG5、CpG6等位點(diǎn)甲基化率無(wú)顯著性差異（P>0.05）；PHI組與非PHI組患者以上各CpG位點(diǎn)甲基化率均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。
　　結(jié)論