5-氟尿嘧啶聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞及其側(cè)群細(xì)胞殺傷作用的體外研究.pdf

1、胃癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,其治療手段有手術(shù)切除、放療、化療等方法,但胃癌的復(fù)發(fā)與耐藥使得治療效果大打折扣。而胃癌的復(fù)發(fā)、耐藥與胃癌干細(xì)胞有著重要的關(guān)系。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC)對(duì)放化療極不敏感,這可能是惡性腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的根源。CSC在腫瘤組織中所占比例極小,而側(cè)群(side population,SP)細(xì)胞富含有原始未分化細(xì)胞,在某種程度上具有類似腫瘤干細(xì)胞的特性,是研究腫瘤干細(xì)胞的理想對(duì)象。<

2、br>　　近年來,生物免疫治療在惡性腫瘤方面的作用逐漸引起人們的關(guān)注,其中以細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cell,CIK)和樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)為主的細(xì)胞免疫治療在基礎(chǔ)及臨床試驗(yàn)中取得了較確切的療效。把 DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞共同培養(yǎng),可起到協(xié)同抗腫瘤的作用。本研究將化療藥物和DC-CIK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用,觀察它們對(duì)胃癌細(xì)胞及其SP細(xì)胞的殺傷效果。
　　第一部分胃癌

3、 BGC-823側(cè)群細(xì)胞的培養(yǎng)及其生物特性的研究
　　目的:
　　化療是胃癌治療最重要的手段之一,但胃癌耐藥性的產(chǎn)生使得治療效果受限,胃癌干細(xì)胞的存在可能是胃癌耐藥性產(chǎn)生的根源,SP細(xì)胞在某種程度上具有類似腫瘤干細(xì)胞的特性,故目前研究多采用SP細(xì)胞進(jìn)行胃癌干細(xì)胞方面的研究。
　　方法:
　　(1)胃癌BGC-823細(xì)胞株從超低溫冷凍箱中取出快速融化解凍,復(fù)蘇成功后并傳代。
　　(2)將BGC-823細(xì)胞接種

4、于無血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM)中懸浮培養(yǎng)。
　　(3)采用直接計(jì)數(shù)法,繪制BGC-823細(xì)胞及其SP細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。
　　(4) MTT比色法檢測(cè)化療藥物5-氟尿嘧啶(5-fuorouracil,5-FU)對(duì)BGC-823細(xì)胞及其SP細(xì)胞的殺傷作用。
　　(5)流式細(xì)胞儀檢測(cè)SP細(xì)胞的細(xì)胞周期。
　　結(jié)果:
　　1 BGC-823細(xì)胞株分離獲得BGC-823-SP細(xì)胞。

5、　　BGC-823細(xì)胞株在無血清培養(yǎng)條件下,7 d左右形成腫瘤細(xì)胞球,折光性好,懸浮生長(zhǎng),細(xì)胞為透亮圓形。
　　2 BGC-823細(xì)胞與BGC-823-SP細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。
　　BGC-823-SP細(xì)胞的增殖速度快于BGC-823細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01)。
　　35-FU對(duì)BGC-823細(xì)胞和BGC-823-SP細(xì)胞的殺傷作用。
　　4種不同濃度的5-FU作用48h后,對(duì)4組BGC-823細(xì)胞的殺傷

6、率均高于相對(duì)應(yīng)的BGC-823-SP細(xì)胞組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4流式細(xì)胞儀檢測(cè)SP細(xì)胞周期。
　　與BGC-823細(xì)胞相比,BGC-823-SP細(xì)胞處于G0/G1期的比例明顯增加。
　　結(jié)論:
　　從BGC-823細(xì)胞中富集到的BGC-823-SP細(xì)胞比BGC-823細(xì)胞的增殖能力和耐藥性更強(qiáng),且多處于細(xì)胞周期的靜止期。
　　第二部分研究5-FU聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞及其側(cè)群細(xì)胞的體外

7、殺傷作用
　　目的:
　　近年來,生物免疫治療在抗腫瘤方面的作用逐漸受到人們的關(guān)注,細(xì)胞免疫治療尤其是DC細(xì)胞、CIK細(xì)胞以及它們共培養(yǎng)的DC-CIK細(xì)胞成為人們的研究熱點(diǎn)。本研究欲通過制備培養(yǎng)DC-CIK細(xì)胞,觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞及胃癌SP細(xì)胞的殺傷作用,并研究在聯(lián)合5-FU后對(duì)胃癌細(xì)胞及其SP細(xì)胞的殺傷作用,以期為臨床上胃癌的治療提供新的策略,并為化學(xué)治療聯(lián)合細(xì)胞免疫治療的綜合療法提供一定的理論依據(jù)。
　　方法:

8、>　　(1)取健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),加入不同細(xì)胞因子,制備培養(yǎng)出DC-CIK細(xì)胞。
　　(2)倒置顯微鏡觀察DC-CIK細(xì)胞的形態(tài)。
　　(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞表型。
　　(4) MTT比色法檢測(cè)不同效靶比的DC-CIK細(xì)胞對(duì)BGC-823細(xì)胞及其SP細(xì)胞的殺傷率。
　　(5)MTT比色法測(cè)定5-FU聯(lián)合

9、DC-CIK細(xì)胞對(duì)BGC-823細(xì)胞及其SP細(xì)胞的殺傷率。
　　結(jié)果:
　　1倒置顯微鏡觀察DC-CIK細(xì)胞形態(tài)
　　倒置顯微鏡下的DC-CIK細(xì)胞呈球形,均勻透亮,細(xì)胞間距小,挨靠緊密。
　　2流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞表型
　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3d和第7d DC細(xì)胞表面分子CD83、CD86、HLA-DR的表達(dá)率分別為(5.79±2.47)％、(18.95±3.21)%、(22.48±3.

10、45)%和(63.67±1.29)%、(70.23±4.06)%、(86.43±2.78)%。第7d DC細(xì)胞CD83、CD86、HLA-DR的表達(dá)率比第3d DC細(xì)胞的明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表明第7d DC細(xì)胞已成熟。
　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)共培養(yǎng)0d DC-CIK細(xì)胞表面分子CD3+、CD8+、CD3+CD56+的表達(dá)率分別為(60.72±3.24)%、(53.87±3.25)%、(8.01±4.67)%,共

11、培養(yǎng)7d DC-CIK細(xì)胞CD3+、CD8+、CD3+CD56+的表達(dá)率分別為(79.54±2.56)%、(73.91±2.43)%、(43.45±2.30)%。共培養(yǎng)7d DC-CIK細(xì)胞表面分子的CD3+、CD8+、CD3+CD56+表達(dá)率比共培養(yǎng)0d DC-CIK細(xì)胞的明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表明共培養(yǎng)7d DC-CIK細(xì)胞已成熟。
　　3 DC-CIK細(xì)胞對(duì)BGC-823、BGC-823-SP細(xì)胞的殺傷

12、作用
　　不同效靶比的4組DC-CIK細(xì)胞對(duì)BGC-823、BGC-823-SP細(xì)胞均有殺傷作用。同一效靶比的DC-CIK細(xì)胞對(duì)BGC-823、BGC-823-SP細(xì)胞的殺傷率相似,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　45-FU聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞對(duì)BGC-823、BGC-823-SP細(xì)胞的殺傷作用
　　5-FU聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞對(duì)BGC-823、BGC-823-SP細(xì)胞的殺傷作用均較各單獨(dú)應(yīng)用組明顯增強(qiáng),且其殺