應用WT1抗原肽體外刺激培養(yǎng)DC-CIK細胞殺傷K562細胞實驗研究.pdf

1、目的:以WT1基因陽性的患者為研究對象，提取其外周血單個核細胞，體外誘導產生樹突狀細胞(DC)，負載WT1復合抗原肽，體外誘導產生細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)，檢測DC細胞與CIK細胞的增殖能力、免疫表型變化，并檢測DC-CIK混合培養(yǎng)后對WT1基因陽性K562細胞的殺傷作用，探索收獲WT1抗原特異性效應細胞的合理途徑。
　　方法:DC細胞的培養(yǎng):抽取WT1陽性白血病患者經肝素抗凝后的外周血，經肝素抗凝后，用淋巴細胞分離液分離

2、獲得單個核細胞(MNC，mononuclear cells)。然后用RPMI1640培養(yǎng)液將細胞濃度調整至5×106/ml，孵育4小時后，提取貼壁細胞，調整細胞濃度為5×106/ml加入6孔培養(yǎng)板中，并加入細胞因子，使得重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)濃度為1000U/ml、重組人白細胞介素-4(rhIL-4)濃度為1000U/ml。第5天加入WTI混合抗原肽50ng/ml，實驗組DC細胞負載WTI混合抗原肽，對照組

3、DC細胞不負載WT1抗原肽，第6天，兩組加重組人腫瘤壞死因子-a(rhTNF-a)，使?jié)舛葹?000U/ml，促進DC細胞成熟。
　　CIK細胞的體外培養(yǎng):同上來源的細胞經過單個核細胞的分離，孵育4小時后，收集懸浮的細胞，將細胞濃度調整至1×106/ml，加入干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)1000U/ml，24小時后加入CD-3單抗(CD-3 monoclonal antibody)50ng/ml，重組人白細胞

4、介素-2(rh-interleukin-2，rhIL-2)500U/ml，以后隔日更換新的培養(yǎng)液并計數，同時補充加入rhIL-2。培育第7天，用臺盼藍排斥法染色DC細胞和CIK細胞，計數活細胞，用完全培養(yǎng)基（含10％胎牛血清的RPMI1640液）調整DC細胞濃度為1×106/ml，CIK細胞濃度為5×106/ml，按照1∶5比例混合，繼續(xù)培養(yǎng)，在共培養(yǎng)的第1天、第3天、第7天收集共培養(yǎng)細胞，計數，應用流式細胞術檢測其免疫分子標記，并檢測

5、其對靶細胞的殺傷活性。
　　結果:
　　1、負載WT1抗原肽組與未負載WT1抗原肽組來源的DC-CIK細胞增殖能力的比較
　　在溫箱中孵育過的貼壁單個核細胞，經過GM-CSF和IL-4誘導后成樹突狀細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，培育中細胞外形發(fā)生變化，細胞量亦有增加。培育48小時后細胞體積較前增大，表面有毛刺樣突起，隨著培育時間的增長，細胞體積明顯增大，細胞邊緣毛刺樣突起增多，變長（見Fig.1）。
　　懸浮單

6、個核細胞在相應細胞因子的誘導下擴增成CIK細胞，并逐漸形成細胞團;CIK細胞最初，散在均勻分布，個小，亮而圓(見Fig.2)。在培養(yǎng)的第3天，細胞形態(tài)開始呈現出不規(guī)則變化，并呈細胞團樣生長(見Fig.3)。從培養(yǎng)的第6天起，細胞明顯增殖，成叢或以集落狀態(tài)生長，并懸浮于培養(yǎng)基中(見Fig.4)。隨著培養(yǎng)時間增長，細胞集落數逐漸增多。經臺盼藍排斥法對活細胞進行計數，第7天，負載WT1抗原肽組DC-CIK細胞的增殖倍數為（10.01±0.71

7、）倍，未負載WT1抗原肽組DC-CIK增生了(10.20±0.60)倍;第14天，負載WT1抗原肽組DC-CIK細胞數為原來的(17.16±0.93)倍，未負載WT1抗原肽組是原來的(17.40±0.94)倍（見Table1）。分析比較同一組細胞的增殖倍數隨時間的增加均有統(tǒng)計學意義，但兩組之間沒有統(tǒng)計學差異，以上結果說明，是否負荷腫瘤抗原肽對DC-CIK的增殖沒有顯著影響。
　　2、負載WT1抗原肽組與未負載WT1抗原肽組的DC-

8、CIK分子免疫表型的變化
　　分別收集培養(yǎng)第1天、7天及14天的兩組培養(yǎng)細胞，通過流式細胞儀檢測細胞分子免疫表型的變化。結果顯示:當天測得白血病患者細胞的分子免疫表型結果如下:CD3+CD8+細胞為(30.34±3.14)％，CD3+CD56+細胞為（5.49±0.45）％。細胞培養(yǎng)的第7天、14天免疫表型檢測結果如下:負載WT1抗原肽組CD3+CD8+細胞為(40.25±2.66)％，(76.48±4.08)％，CD3+CD56

9、+細胞為(9.48±1.06)％，（29.11±4.27）％;未WT1負載抗原肽組CD3+CD8+細胞為(39.61±2.51)％，(75.61±6.27)％，CD3+CD56+細胞為（9.44±1.10）％，(29.11±4.91)％(見Table2)，在DC-CIK細胞的培養(yǎng)過程中，隨著培養(yǎng)時間的增長，負載WT1抗原肽組與未負載WT1抗原肽組來源DC-CIK細胞，其CD3+CD8+及CD3+CD56+雙陽性細胞比例均有顯著提高，但兩

10、組無顯著性差異，即P＞0.05，以上數據說明是否負荷抗原肽對誘導出的DC-CIK細胞的表型沒有影響。
　　3、負載WT1抗原肽組與未負載WT1抗原肽組來源DC-CIK細胞殺傷活性比較
　　采集培養(yǎng)14天的DC-CIK細胞做殺傷實驗，收集培養(yǎng)的負載WT1抗原肽組DC-CIK細胞作為效應細胞，分別以WT1基因(+)的K562細胞和WT1基因(-)的HL60細胞為靶細胞，在效靶比5∶1～20∶1范圍內，比較兩者的殺傷活性。負載WT

11、1抗原肽組DC-CIK在效靶比分別為5∶1，10∶1，20∶1時對K562細胞的殺傷活性結果為(49.21±4.78)％，(74.86±1.55)％，(83.01±2.35)％，同時檢測在相應效靶比下，對HL60細胞的殺傷為(39.18±1.96)％，(60.44±2.79)％，（69.56±1.45）％（見Table3），經過統(tǒng)計學分析，相同效靶比條件下二者的殺傷力有顯著性差異。
　　收集培養(yǎng)的未負載WT1抗原肽組DC-CIK細

12、胞作為效應細胞，分別以WT1基因(+)的K562細胞和WT1基因(-)的HL60細胞為靶細胞，在效靶比5∶1～20∶1范圍內，比較兩者的殺傷活性。負載WT1抗原肽組DC-CIK在效靶比分別為5∶1，10∶1，20∶1時對K562細胞的殺傷活性結果為(38.95±2.03)％，(59.48±3.97)％，(69.19±1.52)％，同時檢測在相應效靶比下，對HL60細胞的殺傷為(39.95±1.45)％，(60.88±1.30)％，(70

13、.08±1.07)％(見Table4)，經過統(tǒng)計學分析，相同效靶比條件下二者的殺傷力無差異。
　　以上數據說明負載WT1抗原肽組和未負載WT1抗原肽組來源DC-CIK細胞對WT1基因(-)的HL60細胞均有殺傷作用，兩組無統(tǒng)計學意義。兩組對WT1(+)的K562細胞的殺傷，負載WT1抗原肽組明顯強于未負載WT1抗原肽組，兩組差異有統(tǒng)計學意義，說明負載WT1抗原肽組來源的DC-CIK細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷。
　　結論:

14、r>　　1、應用白血病患者的外周血單個核細胞通過負荷抗原的的培養(yǎng)方法可培養(yǎng)出DC-CIK細胞，且具有殺傷活性。
　　2、負載WT1抗原肽組與未負載WT1抗原肽組來源DC-CIK細胞，其CD3+CD8+及CD3+CD56+雙陽性細胞比例均有顯著提高，兩組無顯著性差異。
　　3、負載WT1抗原肽組和未負載WT1抗原肽組來源DC-CIK細胞對WT1基因(-)的HL60細胞均有殺傷作用，兩組無統(tǒng)計學意義。
　　4、兩組對WT1