ROS誘發(fā)P53介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育阻滯的影響.pdf

1、近年來，胚胎移植技術(shù)、胚胎分割技術(shù)、胚胎干細(xì)胞工程等極大地促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展，而這些新技術(shù)的應(yīng)用卻受到的胚胎來源的制約。胚胎在體外發(fā)育過程中，常常會(huì)發(fā)生阻滯現(xiàn)象，潛在的機(jī)制迄今還未明了。ROS是生物體內(nèi)產(chǎn)生的超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(·OH)等活性含氧化合物的總稱。課題組前期研究表明，胚胎在體外培養(yǎng)過程中，會(huì)產(chǎn)生ROS導(dǎo)致胚胎氧化應(yīng)激現(xiàn)象，但其詳細(xì)的作用機(jī)理還不明確。腫瘤抑制蛋白P53作為一種細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡

2、的調(diào)控者，與氧化應(yīng)激反應(yīng)具有密切關(guān)聯(lián)，但其在胚胎中所起的作用知之甚少。所以我們假設(shè)P53在胚胎體外發(fā)育過程中在發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)扮演重要作用，圍繞ROS與P53之間的信號(hào)通路的調(diào)控作用，深入探討ROS引起小鼠胚胎體外發(fā)育阻滯現(xiàn)象的機(jī)制。為此，本研究做了以下方面的實(shí)驗(yàn):
　　實(shí)驗(yàn)一、過氧化氫誘導(dǎo)的胚胎氧化應(yīng)激反應(yīng)
　　首先探討不同濃度的過氧化氫以及不同濃度抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)對(duì)胚胎發(fā)育的影響，篩選出本實(shí)驗(yàn)最佳的胚胎氧

3、化應(yīng)激模型為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。結(jié)果表明，隨著過氧化氫濃度的增加（25μM、50μM、100μM），胚胎4細(xì)胞發(fā)育率、囊胚率顯著性降低（p＜0.05），從中優(yōu)選出50μM/L的過氧化氫為最佳應(yīng)激濃度，且在添加不同濃度（1mM、5mM、25mM）的NAC實(shí)驗(yàn)中，5mM時(shí)4細(xì)胞率、囊胚率顯著高于其他組(p＜0.05)，確定了5mM為最佳抗氧化濃度。觀察胚胎內(nèi)部ROS水平發(fā)現(xiàn)，過氧化氫能顯著性增加胚胎內(nèi)部ROS水平，添加NAC能顯著降低胚胎中RO

4、S水平。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合PI染色，發(fā)現(xiàn)過氧化氫刺激的胚胎PI染色相對(duì)其他組較高。為進(jìn)一步評(píng)估氧化損傷程度，對(duì)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA測(cè)定發(fā)現(xiàn)，過氧化氫刺激的胚胎MDA含量顯著性升高。因此，證明了一定濃度的H2O2能夠引起胚胎氧化應(yīng)激，導(dǎo)致ROS升高、MDA表達(dá)增加的胚胎發(fā)育阻滯現(xiàn)象。
　　實(shí)驗(yàn)二、ROS誘導(dǎo)P53信號(hào)通路對(duì)胚胎發(fā)育的影響
　　實(shí)驗(yàn)主要探討應(yīng)激后的胚胎ROS是如何調(diào)控P53及其相關(guān)信號(hào)通路的變化引起阻滯現(xiàn)象發(fā)生。實(shí)

5、驗(yàn)結(jié)果表明，過氧化氫能夠?qū)е翽53基因表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞周期相關(guān)基因cdc2、CDK4、CDK6下調(diào)，尤其是cdc2基因顯著性的降低(p＜0.05)，而且在蛋白水平上也發(fā)現(xiàn)H2O2能夠引起P53-ser15磷酸化蛋白表達(dá)升高以及相應(yīng)的P53蛋白高表達(dá);為了進(jìn)一步探討ROS引起的相關(guān)基因變化是由P53介導(dǎo)發(fā)生，通過抑制劑PFT-α干擾P53表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在P53基因、P53-ser15磷酸化蛋白和P53蛋白表達(dá)顯著性抑制后，GADD45、P

6、21基因的mRNA表達(dá)水平顯著性下調(diào)，而細(xì)胞周期基因cdc2的表達(dá)顯著性高于對(duì)照組與過氧化氫組(p＜0.05)，暗示出在抑制P53表達(dá)后，相關(guān)檢驗(yàn)點(diǎn)基因與細(xì)胞周期基因的表達(dá)與抑制前相比發(fā)生了明顯相反改變，因此ROS引起的胚胎發(fā)育阻滯現(xiàn)象可能是通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)P53介導(dǎo)的信號(hào)通路誘發(fā)的。
　　實(shí)驗(yàn)三、P53在早期胚胎中的氧化還原作用
　　本章實(shí)驗(yàn)繼續(xù)從氧化酶的角度，更深入討論的P53對(duì)早期胚胎體外發(fā)育的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)首先觀察了抑制

7、P53的表達(dá)對(duì)胚胎內(nèi)ROS水平的影響，其后測(cè)定了不同處理下對(duì)抗氧化酶和促氧化酶的基因mRNA、蛋白表達(dá)的影響，來觀察P53對(duì)胚胎內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明，抑制P53表達(dá)會(huì)增加ROS含量，抑制抗氧化酶SOD、GPX等表達(dá)。在無應(yīng)激胚胎中低水平P53可以增加抗氧化酶SOD、GPX等表達(dá)，對(duì)促氧化酶BAX、PUMA等表達(dá)無影響。在胚胎受到氧化應(yīng)激時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)高水平P53表達(dá)，抑制抗氧化酶SOD、GPX等表達(dá)，增加促氧化酶BAX、PUMA等

8、表達(dá)。
　　綜上所述:本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ROS可以誘導(dǎo)體外發(fā)育的早期胚胎發(fā)生氧化應(yīng)激現(xiàn)象，導(dǎo)致胚胎內(nèi)脂質(zhì)過氧化、胚胎發(fā)育受阻等現(xiàn)象的發(fā)生。ROS導(dǎo)致胚胎應(yīng)激，可以誘導(dǎo)P53的高表達(dá)，從而刺激其下游控制檢驗(yàn)點(diǎn)基因GADD45a、P21的表達(dá)來降低細(xì)胞周期進(jìn)程相關(guān)基因cdc2、CDK4的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生阻滯現(xiàn)象。為了驗(yàn)證這種關(guān)系，對(duì)P53進(jìn)行了抑制實(shí)驗(yàn)，充分證明了以上結(jié)果。此外，在對(duì)抗氧化酶與促氧化酶的研究中發(fā)現(xiàn)，P53可以根據(jù)其表達(dá)水