CXCR1-2拮抗劑G31P聯(lián)合吉非替尼對(duì)博來霉素導(dǎo)致的小鼠肺損傷抗的研究.pdf

1、研究背景:趨化因子是由小分子蛋白構(gòu)成的細(xì)胞因子，能吸引白細(xì)胞遷移到感染部位，發(fā)生免疫學(xué)效應(yīng)，它在機(jī)體炎癥反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用。CXC趨化因子是趨化因子超家族的重要成員，與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、損傷修復(fù)、血管形成和腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移侵襲等過程密切相關(guān)。其中，趨化因子CXCL8由上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等分泌，有CXCR1和CXCR2兩個(gè)受體，它通過與兩個(gè)受體的結(jié)合發(fā)揮對(duì)T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等機(jī)體內(nèi)多種炎癥細(xì)胞的趨化作用，它還在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并參與腫瘤

2、的血管生成和轉(zhuǎn)移侵襲的過程。G31P是CXCR1/2受體拮抗劑，可與CXCR1/CXCR2受體高親和力結(jié)合，但沒趨化活性的CXCL8衍生物，它是通過基因定點(diǎn)突變方法構(gòu)建所得到的，可與IL-8競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CXCR1/CXCR2受體，從而阻斷IL-8與CXCR1/CXCR2的結(jié)合，發(fā)揮抗炎抗腫瘤的作用。
　　吉非替尼是非小細(xì)胞肺癌的靶向治療藥物，常用于治療轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者和接受過化療的局部晚期肺癌患者，它是一種選擇性

3、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑，通過選擇性抑制表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶(EGFR-TK)而發(fā)揮作用。高劑量的吉非替尼可接受和轉(zhuǎn)化表皮生長(zhǎng)因子，從而刺激成纖維細(xì)胞增殖，這是造成肺損傷的重要發(fā)病機(jī)制。但研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的吉非替尼能抑制表皮生長(zhǎng)因子的增殖，從而抑制肺損傷的形成。
　　博來霉素屬堿性糖肽類廣譜抗腫瘤藥，它能抑制胸腺嘧啶核苷參入DNA并與之結(jié)合，使得DNA鏈斷裂，常作用于增殖細(xì)胞周期的S期。博來霉素應(yīng)用廣泛，

4、可治療多種腫瘤，如鱗癌，包括皮膚、頭頸部、陰道、宮頸、肺、食道等癌腫以及腦瘤、惡性淋巴瘤、惡性黑色素瘤等。博來霉素常見的不良反應(yīng)有惡心、嘔吐等，但最嚴(yán)重的是引起肺部的間質(zhì)性肺炎，即纖維性肺泡炎（也稱為肺纖維化、肺損傷），其致病性可高達(dá)10％。
　　研究目的:本實(shí)驗(yàn)通過CXCR1/2的拮抗劑G31P與低劑量吉非替尼的聯(lián)合用藥，觀察聯(lián)合用藥對(duì)小鼠肺癌A549細(xì)胞的抑制作用，并研究聯(lián)合用藥對(duì)博來霉素導(dǎo)致小鼠肺損傷的影響，為減輕化療藥物的

5、毒副作用提供新的幫助。
　　研究方法:(1)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):建立博來霉素誘導(dǎo)的肺損傷動(dòng)物模型:取C57BL/6J雌性小鼠60只，隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組（Control組）、博來霉素組(BLM組)、吉非替尼組（Gef組）、吉非替尼+G31P組（Gef+G31P組）、G31P組，每組12只。博來霉素組（BLM組）、吉非替尼組（Gef組）、吉非替尼+G31P組(Gef+G31P組)、G31P組經(jīng)氣管注射博來霉素0.5mg/kg，Con

6、trol組經(jīng)氣管給予同等劑量生理鹽水注射，縫合氣管，密切觀察老鼠活動(dòng)狀態(tài)和體重變化。Gef+G31P組和G31P組小鼠隔天經(jīng)背部皮下注射G31P500μg/kg，其它各組同部位同等劑量注射生理鹽水，Gef組和Gef+G31P組每周5天經(jīng)胃給予吉非替尼(100mg/kg)。21天后，處死全部老鼠，進(jìn)行標(biāo)本采集和處理。取小鼠眼球血于EP管中，把小鼠雙側(cè)肺組織從體內(nèi)剝離，觀察各組小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)狀態(tài)，1/4肺組織固定于4％福爾馬林溶液中，

7、日后進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)，其余放于空白EP管中，用于檢測(cè)MPO活力、提取蛋白進(jìn)行Western檢測(cè)、提取RNA進(jìn)行PCR檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)、iNOS含量的測(cè)定等。
　　(2)體外實(shí)驗(yàn):體外培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞，分別用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)等來檢測(cè)低劑量的吉非替尼聯(lián)合G31P對(duì)A549細(xì)胞體外增殖的影響。
　　研究結(jié)果:(1)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):對(duì)老鼠肺組織大體觀察，Control組肺部正常，無炎癥反應(yīng)發(fā)現(xiàn);BLM組老鼠炎癥反應(yīng)最明顯

8、，肺部組織淤紅;相比BLM組，其它各組炎癥反應(yīng)都有一定程度的緩解，其中Gef+G31P組炎癥最輕。
　　組織病理學(xué)結(jié)果表明，Control組正常，BLM組老鼠的肺泡內(nèi)全部充滿紅細(xì)胞，無明顯肺泡組織;與其它組相比，G31P組和Gef組肺泡內(nèi)紅細(xì)胞明顯減小且存在肺泡組織，G31P+Gef組肺泡內(nèi)基本無紅細(xì)胞，肺泡組織學(xué)形態(tài)正常。
　　從老鼠的體重趨勢(shì)和死亡率來看，G31P+Gef組體重基本與Control組相當(dāng)，其它三組體重明顯

9、下降，以BLM組下降最為明顯。G31P+Gef組死亡率明顯低于BLM組、G31P組和Gef組，BLM組老鼠死亡率高達(dá)50％，G31P組和Gef組死亡率分別為30％和40％。
　　通過qRT-PCR結(jié)果顯示，BLM組老鼠炎癥標(biāo)記物TNF-α(p＜0.05)，IL-1β(p＜0.05)、IL-1(p＜0.05)IL-5(p＜0.05)和IL-6(p＜0.05)明顯高于其它四組。相比之下，Control組的TNF-α(p＜0.05)、I

10、L-1(p＜0.05)、 IL-5(p＜0.05)和IL-6(p＜0.05)的mRNA的表達(dá)水平最低，其它依次為G31P+Gef組、G31P組、Gef組。
　　通過Western-blot結(jié)果顯示，相對(duì)于Control組，G31P聯(lián)合吉非替尼更能明顯抑制肺損傷組織的NF-κB(p＜0.05)的表達(dá)。相比，BLM組蛋白標(biāo)記物的表達(dá)最低，其次分別為Gef組、G31P組。
　　對(duì)小鼠體內(nèi)髓過氧化物酶(MPO)和一氧化氮合酶(iNO

11、S)測(cè)定，結(jié)果表明G31P聯(lián)合吉非替尼可以明顯降低小鼠肺組織中MPO和iNOS的含量。
　　(2)體外實(shí)驗(yàn):用細(xì)胞抑制、細(xì)胞遷移等實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)G31P和吉非替尼對(duì)A549細(xì)胞的增殖和毒性作用，單獨(dú)使用G31P組的結(jié)果顯示對(duì)A549細(xì)胞沒有明顯抑制作用;G31P與低濃度吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)A549細(xì)胞有明顯的細(xì)胞抑制作用;G31P與高濃度的吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用結(jié)果也不太明顯。
　　結(jié)論:(1) G31P與低