CXCR1-2拮抗劑G31P聯(lián)合GDCO941對(duì)乳腺癌治療的增強(qiáng)作用.pdf

1、目的:趨化因子是一種主要由免疫細(xì)胞、某些基質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的可結(jié)合在內(nèi)皮細(xì)胞表面、對(duì)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等不同細(xì)胞具有趨化和激活作用的細(xì)胞因子。CXC趨化因子在炎癥反應(yīng)、血管形成過程和腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，CXCR1/2通過與配體的結(jié)合，激活胞內(nèi)下游信號(hào)通路，除了趨化、活化免疫細(xì)胞外，也在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移，病原微生物感染以及移植排斥反應(yīng)等病理過程中發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)IL-8在多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，促進(jìn)

2、腫瘤的血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移等。G31P是我實(shí)驗(yàn)室通過點(diǎn)突變法人工構(gòu)建得到的對(duì)受體CXCR1/2親和力高于CXCL-8，但無生物學(xué)趨化活性的CXCL-8衍生物，競(jìng)爭(zhēng)性抑制包括IL-8在內(nèi)的多種趨化因子與CXCR1/2的結(jié)合，G31P通過阻斷CXCL-8等細(xì)胞因子的生物學(xué)作用抑制血管生成，從而影響腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。GDC-0941是一種口服、有效且特異性的PI3K/Akt/mTOR選擇性抑制劑，能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)

3、腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制中心母細(xì)胞數(shù)。目前處于臨床試驗(yàn)階段，具有療效好、毒副作用低、患者耐受性好等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過GDC-0941與G31P的聯(lián)合用藥，研究聯(lián)合用藥對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，為腫瘤的臨床治療提供新的思路。
　　方法:體外實(shí)驗(yàn):HCC1954、BT474和4T1細(xì)胞體外培養(yǎng)，分組加藥處理。檢測(cè)方法:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)聯(lián)合應(yīng)用GDC-0941和G31P對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響;蛋白質(zhì)印跡法，檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤細(xì)胞中cl-PA

4、RP、bcl-2和pS6蛋白的表達(dá)情況;克隆形成實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤細(xì)胞成瘤以及增殖能力的影響;細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤細(xì)胞存活能力的影響;細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)于腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響;細(xì)胞周期檢測(cè)，檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞周期分布的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):動(dòng)物模型建立:BALB/C雌性小鼠背部三處乳墊接種接種5×104個(gè)4T1細(xì)胞，于接種腫瘤第10天，小鼠隨機(jī)分為4組，包括GDC-0941+G31P組、GDC-0941組、G31

5、P組和腫瘤對(duì)照(Control)組，每組8只。GDC-0941+G31P組小鼠和G31P組小鼠隔天腹腔注射G31P500μg/kg，其余各組同時(shí)注射等量生理鹽水。GDC-0941組和GDC-0941+G31P組小鼠每日灌胃給藥GDC-0941，130mg/kg，其余各組灌胃等量生理鹽水。標(biāo)本處理:用藥第24天，小鼠全部處死，剝離實(shí)體腫瘤和肺組織。肺組織經(jīng)固定處理后進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)。
　　結(jié)果:(1)體外實(shí)驗(yàn):細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，GDC-0

6、941+G31P組劃痕“愈合”程度顯著低于其余三組，提示聯(lián)合用藥能抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力;蛋白質(zhì)印跡法，結(jié)果顯示GDC-0941+G31P組cl-PARP蛋白表達(dá)較其余三組顯著增加、bcl-2和pS6蛋白表達(dá)較其余三組顯著降低，提示聯(lián)合用藥能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤增殖;克隆形成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示GDC-0941組、G31P組、GDC-0941+G31P組克隆形成數(shù)與對(duì)照組相比都有不同程度減少，GDC-0941+G31P組克隆形成數(shù)目最少

7、(p＜0.01)，提示聯(lián)合用藥能增強(qiáng)GDC-0941單藥對(duì)腫瘤細(xì)胞克隆形成的抑制作用;細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較GDC-0941組存活細(xì)胞數(shù)量減少，G31P組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，GDC-0941+G31P組存活細(xì)胞數(shù)顯著減少(p＜0.05)，提示聯(lián)合用藥能顯著增強(qiáng)GDC-0941對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用;細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比GDC-0941組、G31P組和GDC-0941+G31P組結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)均有不同程度減少，其中

8、GDC-0941+G31P組細(xì)胞數(shù)最少(p＜0.01)，提示聯(lián)合用藥顯著抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力;細(xì)胞周期檢測(cè)，結(jié)果顯示GDC-0941組和G31P組的細(xì)胞周期分布與對(duì)照組無顯著差異，GDC-0941+G31P組S期細(xì)胞數(shù)明顯增多(p＜0.05)，提示聯(lián)合用藥能抑制腫瘤細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，抑制細(xì)胞增殖。
　　(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究顯示，GDC-0941聯(lián)合G31P可明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，GDC-0941+G31P組腫瘤平均體積188.4±2

9、3.32mm3，明顯小于腫瘤組（685.6±109.5）(p＜0.01)，小于單獨(dú)應(yīng)用GDC-0941組（461.2±50.70mm3）(p＜0.01)和單獨(dú)應(yīng)用G31P組（496±46.75mm3）(p＜0.01)，提示聯(lián)合用藥能顯著抑制小鼠乳腺癌實(shí)體瘤體積的增長(zhǎng);肺部轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量以及HE染色顯示，聯(lián)合用藥能有效抑制小鼠乳腺癌向肺部轉(zhuǎn)移;小鼠體重顯示四組之間無顯著差異，提示聯(lián)合用藥的毒副作用可耐受。
　　結(jié)論:(1)GDC-094

10、1聯(lián)合應(yīng)用G31P能明顯抑制小鼠乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，效果強(qiáng)于單獨(dú)應(yīng)用GDC-0941和G31P。
　　(2)GDC-0941聯(lián)合應(yīng)用G31P生物學(xué)毒性可耐受，相比單獨(dú)應(yīng)用GDC-0941和G31P毒副作用無明顯增加。
　　(3)GDC-0941聯(lián)合應(yīng)用G31P有效抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移，效果強(qiáng)于單獨(dú)應(yīng)用兩種藥物，提高小鼠生存率和生命質(zhì)量。
　　(4)GDC-0941聯(lián)合應(yīng)用G31P，相較于單獨(dú)應(yīng)用兩種藥物，更有效的抑制了腫瘤細(xì)