STAT3及其相關(guān)競爭性內(nèi)源RNA在肝內(nèi)膽管癌中的表達(dá)與調(diào)控機(jī)制的初步研究.pdf

1、本文從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 STAT3及其相關(guān)競爭性內(nèi)源RNA在肝內(nèi)膽管癌中的表達(dá)與調(diào)控機(jī)制的初步研究
　　目的:
　　本實驗的目的在于通過研究轉(zhuǎn)錄信號傳導(dǎo)因子及激活子3(Signal Transducer and Activator of Transcription3，STAT3)在肝內(nèi)膽管癌中的表達(dá)情況，明確腫瘤原發(fā)灶、近腫瘤肝組織以及淋巴結(jié)中STAT3表達(dá)及其差異，并從數(shù)據(jù)庫中篩選STAT3相關(guān)的競

2、爭性內(nèi)源RNA(Competing endogenous RNAs，ceRNA)，明確ceRNA與STAT3的表達(dá)相關(guān)性，并進(jìn)一步驗證候選ceRNA在STAT3調(diào)控肝內(nèi)膽管癌過程中的作用。
　　肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(ICC)的發(fā)病率約占肝臟原發(fā)性腫瘤的10％至15％，是發(fā)病率僅次于肝細(xì)胞癌的肝臟原發(fā)惡性腫瘤。肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌起源于肝臟的二級膽管及其分支上皮，其病理學(xué)種類多數(shù)為不同分化程度的腺癌，癌細(xì)胞浸潤性侵襲匯管區(qū)血管或神經(jīng)。因其浸潤性

3、生長的特點，ICC形成肝內(nèi)轉(zhuǎn)移或侵襲肝外淋巴結(jié)甚至臨近器官的幾率大于其他肝臟原發(fā)的惡性腫瘤。在實際的臨床診療過程中，ICC與其他的肝臟原發(fā)的惡性腫瘤相比切除率、治愈率更低，并且缺乏有效的輔助治療方法。截止到目前為止手術(shù)切除仍是治愈肝內(nèi)膽管癌唯一有效的途徑，但因肝內(nèi)膽管癌初期癥狀不明顯且病程發(fā)展較快，確診時有機(jī)會接受根治性手術(shù)治療的患者并不占多數(shù)。
　　STAT3是一類在各種組織與細(xì)胞中廣泛表達(dá)的癌基因，STAT3通過磷酸化的方式被

4、激酶活化，經(jīng)過活化后STAT3通過細(xì)胞因子以及生長因子將其信號向細(xì)胞核內(nèi)傳遞，從而達(dá)到影響靶基因轉(zhuǎn)錄的效果。如促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞生成、促進(jìn)或抑制微血管生成、細(xì)胞粘附等， STAT3是JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的組成部分。
　　競爭性內(nèi)源RNA(ceRNAs)假說:不同種類的RNA之間可以通過位于RNA上的microRNA的結(jié)合位點(MREs)競爭性的結(jié)合，這種彼此之間的競爭性的結(jié)合實現(xiàn)了ceRNAs之間調(diào)控表達(dá)的互相影響，因而形

5、成了一種龐大的競爭性內(nèi)源RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　STAT3的表達(dá)在近期的多項研究中被證實密切影響著腫瘤的預(yù)后，急性髓細(xì)胞性白血病、皮膚癌、非小細(xì)胞型肺癌等腫瘤的無瘤生存期、5年生存率以及中位生存時間被證實與STAT3的表達(dá)相關(guān)。而針對上述腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究表明，microRNA可直接或間接的參與STAT3在腫瘤中的活化調(diào)控。根據(jù)競爭性內(nèi)源RNA假說，ceRNA可通過共同的microRNA結(jié)合位點對其競爭性的結(jié)合，這就提示我們micr

6、oRNA可作為中介將ceRNA與STAT3聯(lián)系在一起。查閱文獻(xiàn)后，我們發(fā)現(xiàn)尚未有研究明確ceRNA在肝內(nèi)膽管癌中調(diào)控STAT3的表達(dá)，這為我們的研究奠定了理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　病理評分區(qū)分表達(dá)情況:
　　對納入本實驗的組織標(biāo)本（腫瘤組織、近腫瘤肝組織、淋巴結(jié)組織）進(jìn)行免疫組化染色，并根據(jù)免疫組化顯色的結(jié)果進(jìn)行評分（陽性細(xì)胞著色程度，陽性細(xì)胞占所觀察同類細(xì)胞數(shù)的百分比），區(qū)分STAT3在腫瘤組織中的高表達(dá)與低表達(dá)。

7、
　　功能學(xué)實驗:
　　本研究構(gòu)建了以pcDNA3.1(-)為載體的STAT3過表達(dá)質(zhì)粒，并將pcDNA3.1-STAT3以及pcDNA3.1空載體導(dǎo)入膽管癌9810細(xì)胞系中。通過劃痕實驗和transwell實驗，探究STAT3過表達(dá)對9810細(xì)胞遷移能力的影響。
　　機(jī)制實驗:
　　查詢ceRNA數(shù)據(jù)庫中篩選STAT3可能的候選ceRNAs(ACSL4、IFNAR2、MAP3K5、MAP3K9、SOD2、TNF

8、RSF10B、XIAP、LncRNA-NEAT1)，RT-PCR檢測8種候選ceRNAs與STAT3表達(dá)之間的關(guān)系。應(yīng)用小分子siRNA干擾候選ceRNA，Real-Time PCR和Western-blot檢測STAT3的表達(dá)情況，初步明確ceRNA對STAT3表達(dá)調(diào)控作用。
　　結(jié)果:
　　免疫組化結(jié)果顯示，在48例肝內(nèi)膽管癌患者腫瘤組織內(nèi)STAT3陽性表達(dá)率為85.4％(48例標(biāo)本中有41例呈陽性表達(dá));而48例近腫瘤

9、肝組織標(biāo)本中STAT3的陽性表達(dá)率為12.5％。納入本實驗的病例中有16例患者發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，我們檢測轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)與原發(fā)腫瘤灶中STAT3的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其中13例淋巴結(jié)STAT3表達(dá)水平比原發(fā)腫瘤中高，占淋巴轉(zhuǎn)移患者總體的81.5％。膽管癌細(xì)胞系中導(dǎo)入STAT3過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-STAT3，劃痕實驗以及transwell實驗表明導(dǎo)入STAT3過表達(dá)的9810細(xì)胞遷移能力高于導(dǎo)入空載體的9810細(xì)胞。PCR結(jié)果提示我們:8種候選ce

10、RNA表達(dá)水平與STAT3表達(dá)水平呈正相關(guān)，其中LncRNA-NEAT1的表達(dá)與STAT3呈顯著相關(guān)(P＜0.001)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)提示并經(jīng)文獻(xiàn)查閱后我們以LncRNA-NEAT1作為主要研究對象，分別采用干擾LncRNA-NEAT1的siNEAT1以及對照siRNA轉(zhuǎn)染RBE細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)實驗組相較于對照組LncRNA-NEAT1以及STAT3的RNA表達(dá)水平均下調(diào)。Western-blot結(jié)果提示實驗組相較于對照組STAT3表達(dá)降低。<

11、br>　　結(jié)論:
　　STAT3在肝內(nèi)膽管癌腫瘤組織中表達(dá)高于近腫瘤肝組織;STAT3能夠促進(jìn)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力;候選ceRNAs（LncRNA-NEAT1）與腫瘤組織中STAT3的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(P＜0.001);LncRNA-NEAT1作為競爭性內(nèi)源RNA可以調(diào)節(jié)STAT3的表達(dá)。
　　第二部分 循環(huán)腫瘤細(xì)胞在原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者外周血中分離捕獲技術(shù)及其應(yīng)用
　　目的:
　　本研究利用循環(huán)腫瘤細(xì)

12、胞直徑大于正常細(xì)胞的特征，采用特定孔徑薄膜濾過富集的方法分離肝細(xì)胞癌患者外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。排除正常細(xì)胞干擾后對循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，結(jié)合實驗室檢查數(shù)據(jù)、臨床資料、病理結(jié)果等分析循環(huán)腫瘤細(xì)胞計數(shù)與肝細(xì)胞癌腫瘤形成之間的關(guān)系。應(yīng)用顯微切割分離已捕獲的單個循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并通過單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增循環(huán)腫瘤細(xì)胞基因組，為肝細(xì)胞癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞高通量測序做前期的準(zhǔn)備工作。
　　循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CircuLating tumor ce

13、ll，CTC）概念的首次提出距今已有一百四十余年的歷史，CTC是指進(jìn)入外周血中的惡性腫瘤細(xì)胞。最近十年來因為富集、分離、鑒別手段的豐富，CTC才得到較為系統(tǒng)的研究。文獻(xiàn)報道證實， CTC在腫瘤的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)中扮演著重要的角色。應(yīng)用CTC作為標(biāo)志物檢測早期患者以及監(jiān)測化療藥物的耐藥性已經(jīng)在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌的臨床診療中得到部分應(yīng)用。循環(huán)腫瘤細(xì)胞微栓子（Circulating tumor microemboli，CTM）是由三個或

14、三個以上CTC聚集而成的癌細(xì)胞栓子，CTM的出現(xiàn)已被近期研究證實與胰腺癌、前列腺癌等腫瘤晚期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)病人群常見于HBV感染史、飲酒史的中年男性或絕經(jīng)期后女性，因其生長速度快、早期無明顯癥狀導(dǎo)致手術(shù)根治性切除率低預(yù)后差。據(jù)統(tǒng)計2012年我國原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)病率占全球發(fā)病率的52.7％為世界第一，我國東部沿海地區(qū)HCC發(fā)病率高于西部內(nèi)陸省份，男性發(fā)病率顯著高于女性（平均4.15∶1）。在全

15、球范圍內(nèi)雖然通過推廣新生兒乙肝疫苗的注射以及針對乙肝病毒攜帶者腹部超聲檢查降低了HCC的發(fā)生率并且提高了腫瘤的早期檢出率，但因各種客觀條件制約以及HCC本身的生物學(xué)特性導(dǎo)致其病死率依然居高不下。
　　CTC因其本身在腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中扮演的重要角色，被應(yīng)用在監(jiān)測HCC轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的機(jī)制研究上。而CTC所攜帶的基因組與腫瘤組織基因組的同源性，可被應(yīng)用于化療藥物耐藥性的監(jiān)測。我們的研究嘗試從肝癌患者外周血中分離捕獲CTC并擴(kuò)增其攜帶的基因

16、組，從而達(dá)到體液活檢的目的。
　　方法:
　　實驗對象為經(jīng)東方肝膽外科醫(yī)院確診的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者，在取得知情同意后，取患者外周血6ml。應(yīng)用友芝友公司生產(chǎn)YZY-CTC-BIOPSY異常細(xì)胞分離染色儀截留細(xì)胞，通過腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)與正常細(xì)胞的區(qū)別鑒別CTC，并應(yīng)用免疫熒光染色的方法對CTC進(jìn)一步確認(rèn)（有效排除正常細(xì)胞干擾）。對確認(rèn)后的CTC進(jìn)行計數(shù)，統(tǒng)計患者術(shù)后病理學(xué)資料、實驗室檢查結(jié)果、臨床檢測指標(biāo)，分析計數(shù)與疾病及其病理

17、數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。顯微激光切割的方法將CTC分離，利用單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增CTC基因組，用于高通量測序或腫瘤病人耐藥性檢測等個體化精準(zhǔn)醫(yī)療的開展。
　　結(jié)果與結(jié)論:
　　本研究應(yīng)用CTC-BIOPSY異常細(xì)胞分離染色儀可以有效的將循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)以及循環(huán)腫瘤細(xì)胞微栓子(CTM)截留在篩孔濾膜上;免疫熒光染色鑒別可以有效的排除WBC對CTC計數(shù)的影響:顯微激光切割平臺可以捕獲薄膜截留的CTC細(xì)胞，并在收集時將CTC與正