YAP通過(guò)激活LRP1啟動(dòng)子促進(jìn)黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展.pdf

1、惡性黑色素瘤（黑色素瘤）是臨床上常見的皮膚黏膜和色素性惡性腫瘤，也是發(fā)病率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一。黑色素瘤系來(lái)源于能產(chǎn)生黑素細(xì)胞的惡性腫瘤，雖然可以發(fā)生于尿道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和其他部位，但大部分皮損來(lái)源于皮膚。皮膚惡性黑色素瘤（cutaneous malignant melanoma，CMM）是皮膚致死率最高的惡性腫瘤，具有易轉(zhuǎn)移、進(jìn)展快、易耐藥、對(duì)放化療不敏感等特點(diǎn)。有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，近年來(lái)全球黑色素瘤新發(fā)病例以3％-7%速度增長(zhǎng)1。20

2、14年數(shù)據(jù)顯示，在美國(guó)76100患者被診斷為黑色素瘤，其中9710患者死亡2,3。雖然黑色素瘤在歐美等白種人中具有較高的發(fā)病率，但近年來(lái)黑色素瘤在我國(guó)的發(fā)病率成倍增長(zhǎng)，每年有新發(fā)病例約2萬(wàn)例4。因此黑色素瘤已經(jīng)成為危害我國(guó)人民健康的疾病之一。原發(fā)性惡性黑色素瘤在臨床上主要分為四型：肢端雀斑痣樣黑色素瘤、惡性雀斑痣樣黑色素瘤、結(jié)節(jié)性黑色素瘤和表淺擴(kuò)散性黑素瘤。在亞洲人和有色人種中，原發(fā)于皮膚的惡性黑色素瘤約占50%-70%，最常見的原發(fā)部

3、位為肢端黑色素瘤，即足底、足趾、手指末端及甲下等部位，其次為粘膜黑色素瘤，如直腸、口與鼻咽等部位。
　　Hippo信號(hào)通路主要成分是核心激酶鏈，包括LATS1/2(large tumor suppressor1/2)、MST1/2(mammalian STE20-like protein kinase)、MOB(MOB kinase activator)和SAV1(human Salvador homology1),上述核心激酶能

4、夠調(diào)控器官的大小、維持細(xì)胞增殖和凋亡的平衡以及能夠調(diào)控細(xì)胞之間接觸性的連接作用。Hippo信號(hào)通路能夠維持表皮真皮交界處基底膜的黑素細(xì)胞密度。YAP（Yes-associated protein）是Hippo信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄激活因子。黑素細(xì)胞和大部分惡性黑色素瘤細(xì)胞系都表達(dá) YAP蛋白。綜上所述，YAP蛋白在黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。
　　低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1（Low-density lipoprotein r

5、eceptor-related protein-1，LRP1）是一類具有清除細(xì)胞因子和信號(hào)傳導(dǎo)功能的細(xì)胞膜受體，可以介導(dǎo)多種細(xì)胞外基質(zhì)中的分子內(nèi)吞及代謝。LRP1在癌癥中發(fā)揮的作用是具有爭(zhēng)議性的，由于LRP1介導(dǎo)的內(nèi)吞可以減少細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白酶的積累，有研究報(bào)道LRP1是抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的一種關(guān)鍵受體分子。也有報(bào)道證明，LRP1可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的粘附，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。而LRP1在黑色素瘤發(fā)病中所起到的作用少有報(bào)道。
　　在

6、本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤 A375細(xì)胞中分別沉默/過(guò)表達(dá) YAP基因和LRP1基因后，黑色素瘤A375細(xì)胞的增殖功能和轉(zhuǎn)移功能相對(duì)于正常表達(dá)YAP蛋白和LRP1蛋白的A375細(xì)胞有所減弱/增強(qiáng)，凋亡增強(qiáng)/減弱。我們進(jìn)一步研究了YAP和LRP1蛋白之間的聯(lián)系以及LRP1蛋白作為黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移以及臨床診斷治療預(yù)后的指標(biāo)的可能性。
　　目的：1.明確沉默/過(guò)表達(dá)YAP基因和LRP1基因后黑色素瘤A375細(xì)胞的功能實(shí)驗(yàn)的一致性；2

7、.明確YAP蛋白和LRP1蛋白在惡性黑色素瘤皮膚組織芯片中和正常皮膚組織芯片中的表達(dá)情況；3.明確YAP蛋白和LRP1蛋白之間的關(guān)系，即YAP基因通過(guò)激活LRP1啟動(dòng)子而促進(jìn)LRP1蛋白表達(dá)；4.過(guò)表達(dá)LRP1蛋白可以逆轉(zhuǎn)沉默YAP基因后黑色素瘤細(xì)胞A375改變的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移能力。
　　方法：1.分別沉默/過(guò)表達(dá)黑色素瘤細(xì)胞A375的YAP基因和LRP1基因，測(cè)試MTT增殖實(shí)驗(yàn)、Caspase3/7凋亡實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Tran

8、swell實(shí)驗(yàn)；2.利用免疫組化實(shí)驗(yàn)（IHC）測(cè)試組織芯片上正常皮膚組織和惡性黑色素瘤皮膚組織的 YAP蛋白和LRP1蛋白的表達(dá)情況；3.利用RT-PCR技術(shù)和Western-blot技術(shù)測(cè)定YAP基因沉默后黑色素瘤A375細(xì)胞YAP和LRP1的蛋白表達(dá)和mRNA和的情況；利用免疫熒光技術(shù)觀察YAP和LRP1蛋白是否有表達(dá)共定位；利用蛋白抑制劑CHX分別處理空白對(duì)照的黑色素瘤A375細(xì)胞和YAP基因過(guò)表達(dá)的黑色素瘤A375細(xì)胞，在0h、

9、1h、2h、4h、8h、24h利用Western-blot技術(shù)檢測(cè)YAP蛋白和LRP1蛋白的表達(dá)情況；利用雙熒光酶報(bào)告基因測(cè)試檢測(cè)LRP1啟動(dòng)子（-2000bp to+150bp）在YAP基因敲除和過(guò)表達(dá)的黑色素瘤A375細(xì)胞中的激活情況；4.過(guò)表達(dá)LRP1基因能逆轉(zhuǎn)沉默YAP基因后削弱的致癌特性。
　　結(jié)論：YAP蛋白和LRP1蛋白均能促進(jìn)黑色素瘤A375細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，抑制凋亡；YAP基因通過(guò)激活LRP1的啟動(dòng)子促進(jìn)黑色素瘤