雙鏈DNA分子中單個錯配堿基對自發(fā)翻轉的動力學研究.pdf

1、在生物物理科學,尤其是生物大分子或生物系統(tǒng)之動力學機制研究中所發(fā)現(xiàn)的越來越多的隨機過程(現(xiàn)象)迅速更新和豐富著人們對于復雜生命科學之認識。在對這些隨機現(xiàn)象探索的過程中,單分子探測技術逐漸發(fā)展成為最有利的研究工具之一。單分子探測最核心之思想在于追蹤并記錄每一個單個生物分子之動態(tài)行為,以便獲得更豐富更細致的具有統(tǒng)計意義的動力學和動態(tài)學信息?；谶@個核心思想,科學家們發(fā)展了用于在熱平衡系統(tǒng)中采集反映單個生物大分子動態(tài)行為的熒光漲落譜——熒光相

2、關光譜技術?？茖W家對采集到的熒光漲落信號進行自/互相關(協(xié)方差)分析,從而從中獲得期望的反映生物大分子動態(tài)行為之熱力學和動力學性質。然而,在復雜生動的生命科學面前,再強大的檢測工具也是不完美的,包括單分子探測和熒光相關光譜技術。
　　DNA/RNA分子中諸如堿基的甲基化、去甲基化、羥基化等過程的DNA/RNA分子堿基修飾/修復過程,因其在表觀遺傳學中之重要意義而越來越多地受到人們之重視和興趣。人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有很多蛋白在修復或修飾目標

3、堿基的過程中都采用將目標堿基翻轉出DNA雙螺旋結構之機制。然而,針對目標堿基怎樣從雙螺旋結構內(nèi)部翻轉出去這一問題,并沒有明確的答案,而其中最核心之問題則在于待修復的目標堿基(受損傷堿基或錯配堿基)能否因其為非Watson-Crick堿基對而自發(fā)翻轉出DNA雙螺旋,并作為動力學信號被修復蛋白識別并且捕獲。這一核心問題得以遺留至今,其主要技術難點在于,堿基翻轉之空間變化非常小,且翻轉行為之動力學弛豫時間尺度在當前主流檢測手段之盲區(qū),因此很難

4、利用現(xiàn)有的實驗手段獲取其自發(fā)翻轉動力學信息。人們曾試圖利用核磁共振譜學和基于快速混合的非平衡態(tài)實驗體系來研究單個堿基翻轉的動態(tài)行為,但終究因技術限制而未能得到準確的令人滿意的結果。
　　針對上述提到的錯配堿基能否自發(fā)翻轉且如何精確探測堿基自發(fā)翻轉動態(tài)行為之問題,本文對熒光相關光譜技術進行了擴展并發(fā)展出降速擴散的熒光相關光譜這一技術。本論文首先介紹了研究堿基自發(fā)翻轉動力學之目的及其重要意義,以及針對該問題的當前國內(nèi)外的研究進展。其次

5、,將簡單介紹單分子技術,尤其是熒光相關光譜技術之基本原理和一些簡單應用。隨后基于之前介紹的熒光相關光譜的基本原理,將主要介紹本文從理論及實驗兩方面對共擴散的多個熒光基團的熒光相關光譜之研究。該研究表明,在共擴散的多個熒光基團體系的熒光相關光譜中,由熒光基團本身光物理性質或其他化學反應導致的相關光譜的衰減之振幅,與其共擴散的熒光基團之數(shù)目成反比關系。
　　然后,本論文將介紹作者對降速擴散熒光光譜技術之開發(fā)和研究。為了減緩待測分子自由

6、擴散之速度,作者將待測分子鏈接于直徑為微米級的聚丙烯小球之上,并成功使得待測分子在小球之“拖拽”作用下,于共聚焦區(qū)域的特征停留時間延長至約1秒鐘之久,足以用來探測動力學弛豫從亞毫秒到幾十毫秒數(shù)量級的化學反應或構象動態(tài)學變化。另外在這一部分,還將以DNA發(fā)卡分子之折疊動力學為模型體系,對所開發(fā)的降速擴散熒光相關光譜可用性進行了測試和論證。通過降速擴散熒光相關光譜,本文第一次同時捕獲到多個折疊中間態(tài)和最終折疊態(tài)的動力學弛豫過程,為之前的理論

7、預言提供了可靠的實驗依據(jù)。
　　最后,本論文對錯配堿基對自發(fā)翻轉動力學之研究進行了詳細闡述。利用之前開發(fā)的降速擴散熒光相關光譜,作者發(fā)現(xiàn),相比正常的Watson-Crick堿基對,錯配的堿基對有一定幾率自發(fā)翻轉出DNA分子雙螺旋結構,并在其雙螺旋外的位置停留約幾毫秒之久,為蛋白識別目標堿基以及堿基翻轉分子機制之研究提供了重要的動力學依據(jù)。另外作者的實驗還表明, T-T錯配相比T-G錯配而言,其在雙螺旋內(nèi)之結構相對更不穩(wěn)定,這也與之