貝伐單抗類似物電荷異構(gòu)體的分離與評(píng)價(jià)研究.pdf

1、單克隆抗體是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子，很多原因會(huì)導(dǎo)致分子表面電荷數(shù)量發(fā)生變化而形成電荷異構(gòu)體。貝伐單抗是抗VEGF受體的重組人源化單克隆抗體，臨床用于結(jié)直腸癌的治療，而且對(duì)非小細(xì)胞肺癌、腎癌和其它多種實(shí)體瘤治療前景樂(lè)觀。本文主要研究貝伐單抗生物類似物電荷異構(gòu)體的理化修飾是否對(duì)體外活性及體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生影響。論文內(nèi)容包含三個(gè)部分：
　　1.貝伐單抗類似物電荷異構(gòu)體的制備
　　使用AKTA AVANT150自動(dòng)層析儀，分別采用

2、SP-HP及MonoS強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析柱用于制備高純度的酸性變體、堿性變體及主體蛋白。酸性變體分離方法經(jīng)過(guò)優(yōu)化，分離條件為強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱SP-HP，洗脫緩沖液為25 mmol/L MES，75 mmol/L NaCl，pH5.9；主體蛋白和堿性變體的分離方法經(jīng)過(guò)優(yōu)化，分離條件為強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱MonoS，洗脫緩沖液A(25mmol/LMES，50mmol/LNaCl，pH5.9)，洗脫緩沖液B(25mmol/LMES，500mmol/LN

3、aCl，pH5.9)，線性梯度洗脫(B：10％-30%，20 CV)，流速為4 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，分離得到的蛋白使用弱陽(yáng)離子交換色譜進(jìn)行純度的檢測(cè)，結(jié)果顯示酸性變體的純度最高達(dá)到97.6%，主體蛋白純度達(dá)到94.6%，堿性變體純度達(dá)到88.7%。
　　2.表征及體外活性
　　使用CEX-HPLC、CZE、SEC-HPLC、iCIEF及Biacore-X100等分析方法分別對(duì)貝伐單抗類似物電荷異構(gòu)體、貝伐單

4、抗類似物及原研藥的純度、等電點(diǎn)、單體含量及親和力常數(shù)等理化特性進(jìn)行表征。弱陽(yáng)離子交換色譜測(cè)定酸性變體、堿性變體及主體蛋白的純度分別為97.6%、88.7%及94.6%，貝伐單抗類似物和原研藥中酸性變體含量分別14.8%、15.0%，堿性變體含量分別為10.2%、11.0%，主體蛋白含量分別為75.0%、74.0%；酸性變體、堿性變體、主體蛋白、貝伐單抗類似物及原研藥的SEC-HPLC單體檢測(cè)結(jié)果分別為99.4%、98.6%、99.0%、

5、98.5%及97.4%；iCIEF測(cè)定貝伐單抗類似物的等電點(diǎn)與原研藥完全一致為8.10~8.40，酸性變體、主體蛋白及堿性變體等電點(diǎn)分別為7.60~8.20、8.20~8.30、8.30~8.70；酸性變體、堿性變體、主體蛋白、貝伐單抗類似物和原研藥的親和力常數(shù)分別為(2.90±0.12)×10-10 M、(2.64±0.13)×10-10 M、(2.08±0.16)×10-10 M、(3.18±0.22)×10-10 M、(3.21±

6、0.24)×10-10 M。使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)對(duì)電荷異構(gòu)體、貝伐單抗類似物及原研藥進(jìn)行體外活性的比較研究，與原研藥相比，酸性變體、堿性變體、主體蛋白及貝伐單抗類似物的相對(duì)活力分別為94%、100%、114%和100%。
　　3.大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究
　　實(shí)驗(yàn)使用SD(Sprague dawley)雄性大鼠，共分5組，分別為酸性變體、堿性變體、主體蛋白、貝伐單抗類似物及原研藥組；給藥劑量為10 mg/kg，靜

7、脈注射，眼內(nèi)眥取血200μL，取血時(shí)間點(diǎn)為0min、5min、15min、30min；1h、4h、8h、24h；2d、3d、7d、10d、14d、17d、21d、24d、28d、31d、35d、42d；冰水浴中全血靜置30 min，離心取上清，血清-70℃保存。使用受體結(jié)合的直接Elisa方法測(cè)定血清樣品中抗VEGF的抗體的濃度。運(yùn)用非室模型模擬及WinNonlin6.3軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)最大血藥濃度，半衰期及藥時(shí)曲線下面積。酸性變

8、體、堿性變體、主體蛋白、貝伐單抗類似物和原研藥的最大血藥濃度(Cmax)分別為216.45±59.07μg/mL、212.63±52.30μg/mL、202.31±57.06μg/mL、207.00±41.95μg/mL、211.97±44.54μg/mL；半衰期(t1/2)分別為8.67±2.46 d、6.85±2.18 d、8.47±2.38 d、7.68±1.75 d、8.84±1.86 d；藥時(shí)曲線面積(AUC0-42d)分別為