胚胎早期發(fā)育過(guò)程中CTB和EVT的基因表達(dá)譜研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用不同濃度胰酶消化法分別消化正常妊娠8～12周的人工流產(chǎn)絨毛和蛻膜組織，分離得到純度較高的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(CTB)和絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞(EVT)；利用高通量的基因芯片技術(shù)制備CTB和EVT基因表達(dá)譜芯片，對(duì)比分析獲取差異表達(dá)基因。同時(shí)，對(duì)CTB的標(biāo)志物HAI-1基因及其表達(dá)產(chǎn)物在絨毛組織中的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了初步研究。為探討胚胎早期發(fā)育過(guò)程中滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。 方法：l、收集正常妊

2、娠第8～12周絨毛和蛻膜組織，胰酶消化法分離CTB和EVT，分析細(xì)胞純度和活性。 2、提取CTB和EVT的總RNA，檢測(cè)RNA純度和完整性。 3、RNA送公司制備基因芯片，并提取基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。 4、分析數(shù)據(jù)，獲取差異表達(dá)基因。 5、選取兩個(gè)差異表達(dá)基因MMP-9和TIMP-1，RT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果可靠性。 6、分析差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能，并對(duì)基因進(jìn)行分類(lèi)檢索。 7、RT-PCR和免

3、疫組織化學(xué)法檢測(cè)CTB標(biāo)志物HAI-1基因和蛋白 在絨毛組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)。 結(jié)果：1、運(yùn)用不同濃度胰酶消化法消化絨毛和蛻膜組織，獲得純度較高的CTB和EVT。 2、RNA純度及完整性分析，A260／280達(dá)到1．9～2．1，28SrRNA和18SrRNA電泳條帶清晰，亮度之比約為2：l，表明所抽提的RNA達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。 3、建立了CTB和EVT的基因表達(dá)譜芯片，質(zhì)控合格。RT-PCR驗(yàn)證MMP-9和TIM

4、P-1表達(dá)與芯片結(jié)果一致，證實(shí)芯片結(jié)果可信。 4、芯片檢測(cè)CTB和EVT基因表達(dá)譜，在全基因組54675個(gè)基因(或EST)中，共篩選到1318個(gè)差異表達(dá)基因(或EST)，占約2．4％：聚類(lèi)分析結(jié)果顯示上調(diào)基因813個(gè)，下調(diào)基因505個(gè)。所有差異表達(dá)基因按GeneOntoloty功能分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了功能檢索分類(lèi)。 5、綜合分析不同生物學(xué)功能類(lèi)別的1318個(gè)差異表達(dá)基因(或EST)，共檢索到細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因上調(diào)29個(gè)、下調(diào)1

5、1個(gè)；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因上調(diào)87個(gè)、下調(diào)53個(gè)；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因上調(diào)80個(gè)、下調(diào)40個(gè)；細(xì)胞生長(zhǎng)／維持相關(guān)基因上調(diào)41個(gè)、下調(diào)15個(gè)；代謝相關(guān)基因上調(diào)95個(gè)、下調(diào)36個(gè)；凋亡相關(guān)基因上調(diào)17個(gè)、下調(diào)11個(gè)；物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因上調(diào)104個(gè)、下調(diào)47個(gè)；細(xì)胞周期相關(guān)基因上調(diào)16個(gè)、下調(diào)7個(gè)；應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因上調(diào)6個(gè)、下調(diào)0個(gè)；細(xì)胞防御反應(yīng)相關(guān)基因上調(diào)4個(gè)、下調(diào)5個(gè)；免疫應(yīng)答相關(guān)基因上調(diào)69個(gè)、下調(diào)5個(gè)；細(xì)胞黏附相關(guān)基因上調(diào)46個(gè)、下調(diào)28個(gè)；發(fā)

6、育相關(guān)基因上調(diào)58個(gè)、下調(diào)21個(gè)。此外，通過(guò)檢索，我們發(fā)現(xiàn)有327個(gè)基因尚無(wú)功能描述，其中上調(diào)195個(gè)、下調(diào)132個(gè)。 6、RT-PCR測(cè)得HAI-1基因在絨毛組織中有表達(dá)，且其表達(dá)量隨妊娠周數(shù)增加而逐漸上調(diào)，在妊娠第6周HAI-1基因表達(dá)量極低，隨后表達(dá)量逐漸升高，至第9周達(dá)高峰，且高峰持續(xù)至第10周。免疫組織化學(xué)法顯示HAl-1蛋白表達(dá)隨妊娠周數(shù)增加呈遞增趨勢(shì)，與RT-PCR結(jié)果吻合。 結(jié)論：1、采用不同濃度胰酶消化

7、、紅細(xì)胞裂解和Percoll梯度離心等方法成功分離CTB和EVT，這是對(duì)傳統(tǒng)方法的改進(jìn)，既方便實(shí)用，又可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)。 2、建立了CTB和EVT的全基因組表達(dá)譜芯片，并獲取差異表達(dá)基因，其中某些基因是目前尚未報(bào)道生物學(xué)功能或在胚胎發(fā)育方面無(wú)相關(guān)報(bào)道的新基因，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)還印證了當(dāng)前已經(jīng)報(bào)道和胚胎發(fā)育相關(guān)的基因。 3、通過(guò)綜合分析不同生物學(xué)功能類(lèi)別的差異表達(dá)基因的表達(dá)變化，提示滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲可能存在以下一些調(diào)節(jié)機(jī)制：細(xì)胞黏

8、附和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)活躍，如MMP-1、MMP-2、MMP-9，ICAM-1等基因上調(diào)明顯，表明這些基因參與了EVT識(shí)別、黏附、并降解細(xì)胞外基質(zhì)，侵入血管內(nèi)皮使母體血管重建，從而開(kāi)啟胎盤(pán)的血流供應(yīng)這一過(guò)程；免疫應(yīng)答和細(xì)胞防御反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，參與母體對(duì)胎兒的免疫“容受性”調(diào)節(jié)，使胎兒免受母體的免疫排斥；眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因發(fā)生改變，總體趨勢(shì)是使細(xì)胞向增殖期轉(zhuǎn)變，發(fā)生增殖和分化，有序地形成功能不同的組織和系統(tǒng)，