Wip1在間充質(zhì)干細(xì)胞治療小鼠1型糖尿病模型中的功能研究.pdf

1、目的：利用小鼠1型糖尿?。╰ype1 diabetes, T1D）模型，探討Wip1在間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）治療T1D中的調(diào)控作用和Wip1缺失對(duì)MSCs免疫調(diào)節(jié)能力的影響，闡明MSCs治療T1D的機(jī)制，為MSCs的臨床應(yīng)用提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.小鼠T1D模型的建立。分別對(duì)小鼠給予連續(xù)小劑量腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin, STZ）建立緩

2、慢模型（slow-type model）或單次大劑量腹腔注射鏈脲佐菌素建立快速模型（fast-type model）。比較兩種模型小鼠的血糖變化、體重改變、生存狀態(tài)及胰島病理學(xué)改變，選擇最佳建模方法。
　　2.分離培養(yǎng)Wip1野生型（Wip1+/+）MSCs和Wip1缺失型（Wip1-/-）MSCs。取1周齡乳鼠鼠尾提取基因組 DNA，行 Wip1基因型鑒定，分別從 Wip1+/+和Wip1-/-小鼠的骨實(shí)質(zhì)組織提取并培養(yǎng)MSCs

3、；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測 MSCs細(xì)胞表型；誘導(dǎo) MSCs向成脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化，通過油紅O染色法檢測MSCs的成脂分化能力，堿性磷酸酶染色法檢測MSCs的成骨分化能力。
　　3. Wip1在 MSCs治療小鼠 T1D中的作用。建立小鼠 T1D模型，并給予Wip1+/+MSCs或Wip1-/-MSCs治療。通過監(jiān)測隨機(jī)血糖變化；HE染色和胰島素免疫組化染色檢測胰島病理改變情況；流式細(xì)胞術(shù)和RT-PCR檢測脾臟

4、T細(xì)胞亞群與炎性因子的表達(dá)差異；HE染色、Masson染色、PASM染色和RT-PCR檢測腎臟病變程度，比較Wip1+/+MSCs與Wip1-/-MSCs對(duì)小鼠T1D模型治療效果的差異。
　　4. Wip1調(diào)控MSCs免疫調(diào)節(jié)功能的作用機(jī)制。對(duì)T1D模型小鼠分別輸注熒光標(biāo)記的Wip1+/+MSCs和Wip1-/-MSCs，分別于第3天和第7天收取小鼠脾臟，病理組織切片法結(jié)合免疫熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測MSCs的歸巢能力，RT-PCR檢測脾

5、淋巴細(xì)胞內(nèi)Notch1與Hes1的表達(dá)水平；并通過免疫組織化學(xué)法檢測NICD的活化情況；同時(shí)在體外將 DC分別與 Wip1+/+MSCs或 Wip1-/-MSCs共培養(yǎng)，檢測MSCs對(duì)DC成熟及DC內(nèi)Notch1及Hes1表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1、兩種模型建立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，緩慢模型與快速模型的小鼠胰島組織均受到明顯破壞，表現(xiàn)為胰島β細(xì)胞減少，血糖上升。但是緩慢模型組小鼠的體重下降較緩慢，血糖呈現(xiàn)逐步上升趨勢(shì)，建

6、模后8周內(nèi)總死亡率為10％；而快速模型組小鼠體重下降迅速，建模早期血糖急劇上升，建模后8周內(nèi)總死亡率為35%。緩慢模型血糖變化符合不接受干預(yù)的臨床患者血糖變化規(guī)律，同時(shí)可避免因高死亡率造成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差，因此，本研究選用小鼠T1D緩慢建模法。
　　2、利用骨片分離法分離獲得 Wip1+/+MSCs與 Wip1-/-MSCs，細(xì)胞形態(tài)呈長梭形，傳至3代后Wip1-/-MSCs的生長速度顯著低于Wip1+/+MSCs；流式細(xì)胞術(shù)檢測兩

7、種MSCs細(xì)胞表型，結(jié)果顯示，均高表達(dá)CD29、Sca-1及CD90；不表達(dá)CD11b、CD34、CD45、CD31及MHCII；其中Wip1-/-MSCs向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，脂滴的大小、密度較 Wip1+/+MSCs更小更細(xì)；向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后， Wip1-/-MSCs的堿性磷酸酶活性也低于Wip1+/+MSCs。
　　3、將 Wip1+/+MSCs與 Wip1-/-MSCs分別輸注小鼠 T1D模型，結(jié)果表明， Wip1-/

8、-MSCs較Wip1+/+MSCs抑制血糖升高和保護(hù)胰島β細(xì)胞的能力均減弱，且降低Th1/Th2比值、下調(diào)炎性因子IFN-γ、TNF-α的表達(dá)以及上調(diào)IL-4、IL-10、IL-17、Foxp3表達(dá)的能力亦顯著低于Wip1+/+MSCs。Wip1-/-MSCs治療組的腎臟器官中TGF-β1/SMAD通路激活水平明顯高于Wip1+/+MSCs治療組，I型膠原纖維的表達(dá)水平高，Masson染色顯示腎小球纖維化增多；同時(shí) PASM染色顯示W(wǎng)i

9、p1-/-MSCs治療組小鼠腎小球系膜基質(zhì)含量多于Wip1+/+MSCs治療組。
　　4、Wip1缺失對(duì) MSCs歸巢能力影響的研究結(jié)果表明，輸注 Wip1+/+MSCs與Wip1-/-MSCs治療T1D模型鼠，第3d或第7d歸巢至脾臟的細(xì)胞數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Wip1+/+MSCs治療組脾細(xì)胞 Notch1活化片段 NICD含量高于Wip1-/-MSCs治療組，且Wip1+/+MSCs治療組脾細(xì)胞中Notch1和Hes1的mRNA

10、表達(dá)水平也顯著高于 Wip1-/-MSCs治療組；進(jìn)一步，將 DC與 Wip1+/+MSCs或Wip1-/-MSCs體外共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Wip1-/-MSCs促進(jìn)DC內(nèi)Notch信號(hào)通路活化的能力減弱。
　　結(jié)論：Wip1缺失導(dǎo)致 MSCs分化能力下降，Wip1-/-MSCs保護(hù)胰島功能，恢復(fù)T1D小鼠免疫平衡，緩解糖尿病腎臟病變的能力均弱于Wip1+/+MSCs，這可能與Wip1缺失抑制了MSCs激活免疫細(xì)胞內(nèi)Notch1/Hes1