農桿病毒法轉基因植物疫苗的初步研究.pdf

1、煙草壞死病毒A(TobacconecrosisvirusA，TNV-A)是單鏈RNA病毒，它的全基因組序列已被測出，含有6個開放表達閱讀框。本研究利用套疊PCR的方法將克隆于pMD18-T載體上煙草壞死病毒A(TNV-A)基因的ORFⅣ與ORFⅤ(外殼蛋白)之間的非編碼區(qū)形成突變SphI位點，構建了7個中間載體：pBSac-1、pMD18-TNV-1、pBSac-2、pMD18-TNV-S、pUCm-GFP、pUCm-LTB、pBluS

2、KP-TNV-S。 將綠色熒光蛋白基因(GFP)、不耐熱性腸毒素B亞單位(LTB)基因插入SphI突變位點，最后將突變后并連有GFP、LTB目的基因以及只含有突變的SphI酶切位點但未連有任何目的基因的TNV-A全基因插入植物表達載體pE1802的SalI/SmaI之間，構建成植物病毒載體pE-TNV-GFP、pE-TNV-LTB、pE-TNV。將這三種病毒載體轉入農桿菌EHA105中，構建了農桿菌工程菌。 使用2ml沒

3、有針頭的注射器將這三種農桿菌懸浮液壓力滲透至心葉煙植株的葉片。每株注射約100μL的懸浮菌液，2周左右接種部位有可見枯斑，但未接種部位的葉片未見有枯斑。提取帶有的枯斑心葉煙葉片總RNA，進行RT-PCR證實這三種病毒載體可以在心葉煙植株中局部表達。 利用農桿菌介導的葉盤法轉化煙草，通過抗性篩選，獲得三種生長狀況良好的轉基因煙草植株，進一步通過PCR、RT-PCR證實三種病毒基因已經在煙草中表達。 本研究利用實驗室保存的農