RNAi轉(zhuǎn)基因植物基于DNA的快速精確檢測(cè)方法研究.pdf

1、RNAi技術(shù)在轉(zhuǎn)基因植物上的應(yīng)用越來(lái)越廣,包括已經(jīng)允許商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物中,但目前對(duì)RNAi轉(zhuǎn)基因植物的快速精確檢測(cè)技術(shù)相對(duì)滯后。本研究的目的在于建立基于DNA的RNAi轉(zhuǎn)基因植物快速精確的檢測(cè)體系,實(shí)現(xiàn)對(duì)RNAi轉(zhuǎn)基因植物的有效檢測(cè),彌補(bǔ)現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)的不足。檢測(cè)體系的建立主要基于探針的制備、多重PCR、全基因組擴(kuò)增、基因芯片雜交技術(shù)及PCR產(chǎn)物的變復(fù)性電泳等幾個(gè)方面。
　　 關(guān)于探針的制備,首先通過查閱大量文獻(xiàn)搜集并

2、整理了RNAi轉(zhuǎn)基因事件中常用轉(zhuǎn)基因元件37個(gè),包括啟動(dòng)子14個(gè),終止子4個(gè),選擇標(biāo)記基因5個(gè),報(bào)告基因2個(gè)和內(nèi)含子12個(gè)。根據(jù)上述轉(zhuǎn)基因元件的保守序列設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增獲得點(diǎn)制芯片的探針。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照用于后期芯片雜交實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量監(jiān)控。其中陽(yáng)性對(duì)照為真核生物中普遍存在的18S rDNA,陰性對(duì)照為野豬肝臟中表達(dá)的一個(gè)基因,空白對(duì)照為不含任何核酸的點(diǎn)樣液。探針經(jīng)PCR方法擴(kuò)增獲得,擴(kuò)增產(chǎn)物純化定量后用于點(diǎn)制基因芯片。

3、>　　 本研究搜集了8種植物樣品作為檢測(cè)對(duì)象,包括4種RNAi轉(zhuǎn)基因水稻,2種普通轉(zhuǎn)基因植物,1種轉(zhuǎn)空載體的對(duì)照轉(zhuǎn)基因水稻,1種野生型水稻。提取上述樣品的基因組DNA,取一部分樣品進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片雜交；另一部分樣品進(jìn)行全基因組擴(kuò)增,獲得足夠雜交的樣品并經(jīng)片段化處理后與芯片雜交。
　　 本研究?jī)?yōu)化了多重PCR體系及基因組片段化體系,獲得了適用于芯片雜交的樣品。開展了樣品OsBTF3,OsCtBPA,R1和pTC

4、K303的多重PCR產(chǎn)物與芯片雜交實(shí)驗(yàn):以及OsCtBPA基因組樣品與芯片雜交實(shí)驗(yàn)。兩種樣品處理方式的雜交結(jié)果顯示:多重PCR樣品與芯片雜交后檢測(cè)到強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)基因元件的信號(hào),基因組樣品與芯片雜交檢測(cè)到陽(yáng)性對(duì)照、水稻基因組元件及轉(zhuǎn)基因元件的信號(hào)。芯片雜交實(shí)驗(yàn)取得成功,其結(jié)果可用于下一步實(shí)驗(yàn)。但結(jié)果中存在一些假陽(yáng)性,因此芯片雜交實(shí)驗(yàn)有待進(jìn)一步完善。
　　 本研究以樣品OsCtBPA為例,根據(jù)兩次芯片雜交實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的啟動(dòng)子和終止子設(shè)計(jì)

5、引物,擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因目的片段,根據(jù)RNAi結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),利用變復(fù)性電泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了檢測(cè)驗(yàn)證。結(jié)果表明,擴(kuò)增得到的RNAi轉(zhuǎn)基因目的片段,變復(fù)性后條帶位置的確發(fā)生了變化,而轉(zhuǎn)空載體的對(duì)照則沒有,說明變復(fù)性電泳實(shí)驗(yàn)是可行的。本研究下一步將對(duì)其它樣品進(jìn)行檢測(cè)。
　　 本研究經(jīng)過對(duì)探針制備、樣品準(zhǔn)備、芯片點(diǎn)制、芯片雜交和變復(fù)性電泳等實(shí)驗(yàn)體系的摸索和優(yōu)化,初步建立了依據(jù)DNA來(lái)檢測(cè)鑒定是否為RNAi轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)體系,可以用于對(duì)RNAi轉(zhuǎn)基因植