MultiBac高效展示系統(tǒng)建立及VSV-G融合修飾的應用研究.pdf

1、桿狀病毒表面展示系統(tǒng)是近年來快速發(fā)展的一種真核生物表面展示系統(tǒng)，其主要原理是將外源基因與囊膜蛋白基因進行融合，導入昆蟲細胞內(nèi)進行融合表達，使外源蛋白在囊膜蛋白的介導下展示在重組桿狀病毒囊膜或被感染的細胞膜表面。桿狀病毒表面展示系統(tǒng)具有病毒滴度高、外源基因容納能力大、翻譯后修飾機制完善等優(yōu)點，已廣泛應用于基因呈遞、癌細胞靶向攻擊、單克隆抗體制備和新型多價疫苗研發(fā)等領域。桿狀病毒表面展示系統(tǒng)中，常使用GroupⅠ型桿狀病毒的GP64介導外源

2、蛋白的融合展示，該蛋白具有分布極性，其受體位點僅存在于桿狀病毒囊膜極性區(qū)域。病毒復制周期中，野生型GP64蛋白常與GP64融合蛋白之間發(fā)生強烈的競爭性抑制，引起桿狀病毒表面展示效率低等缺點。
　　為了有效解決桿狀病毒的表面展示和基因呈遞效率低等缺陷，本研究利用細菌內(nèi)同源重組、雙熒光素酶檢測，Westren Blot鑒定和激光共聚焦斷層掃描等技術，分別開展了突變型rSw106-inv菌株（Ac-Zeo-ph\Δp64）的構建、Ac-

3、Zeo-ph\Δp64應用于重組桿狀病毒的復制周期研究、Ac-Zeo-ph\Δp64應用于重組桿狀病毒的表面展示效率檢測和Ac-Zeo-ph\Δp64進行VSV-G介導的融合展示等研究，獲得如下結(jié)果：
　　1）Ac-Zeo-ph\Δp64的構建
　　利用over-lap PCR技術構建出同源重組片段，電轉(zhuǎn)化導入Invasin介導的DAP缺陷型Sw106受體菌E.coliAcMultiBac/Δasd Sw106/PGB2ΩI

4、nv（野生型rSw106-inv菌株Ac），完成細菌內(nèi)Red同源重組過程，成功構建了延遲rAcMultiBac中gp64基因表達的突變型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-ph\Δp64。
　　2）Ac-Zeo-ph\Δp64應用于重組桿狀病毒的復制周期研究
　　對突變型rAcMultiBac進行延遲表達野生型GP64蛋白等研究，結(jié)果表明延遲表達野生型GP64蛋白對重組桿狀病毒復制周期無明顯影響。
　　3）Ac-Ze

5、o-ph\Δp64應用于重組桿狀病毒的展示效率檢測
　　將海腎熒光素酶報告基因和 gp64基因進行融合，利用螢火蟲熒光素酶報告基因作為內(nèi)參基因，共同導入突變型 rAcMultiBac，雙熒光素酶檢測技術對重組桿狀病毒的表面展示效率進行檢測。結(jié)果表明，應用突變型 rSw106-inv菌株 Ac-Zeo-ph\Δp64構建的重組桿狀病毒可將表面展示效率提高約0.8倍。
　　4）應用Ac-Zeo-ph\Δp64開展VSV-G介導的

6、融合展示研究
　　vsv-g基因的密碼子使用偏好性分析結(jié)果表明，vsv-g基因在sf9細胞中具有較好的表達效果。利用Ac-Zeo-ph\Δp64成功構建了VSV-G介導的egfp展示重組桿狀病毒。激光共聚焦掃描顯微鏡檢測結(jié)果表明，VSV-G介導的外源蛋白均成功的展示在sf9細胞膜表面，Western Blot鑒定結(jié)果表明外源蛋白成功組裝至子代桿狀病毒。
　　該研究成功構建了可應用于桿狀病毒多基因高效展示系統(tǒng)的菌株平臺，均有效