毛蚶(Scapharca kagoshimensis)血紅蛋白的類酚氧化酶活性及其cDNA克隆的研究.pdf

1、毛蚶(Scapharca kagoshimensis)是隸屬于軟體動物門瓣鰓綱的一種具有重要經(jīng)濟價值的海洋無脊椎動物，其缺乏真正意義上的抗體、沒有免疫記憶能力，只能依靠非特異性免疫反應來抵御寄生蟲和疾病，其中血細胞和免疫因子在其對多種病原微生物的免疫防御反應中起著決定性作用。血紅蛋白(hemoglobin，Hb)是所有脊椎動物和部分無脊椎動物血液中所含有的一大類含鐵的呼吸蛋白，除具有運輸氧氣的主要功能外，還具有穩(wěn)定血壓、抗菌、運輸硫化物

2、、調(diào)節(jié)酸堿平衡、氧化酶、過氧化酶活性等多種生物學功能，是最具有研究價值的蛋白質(zhì)家族之一。在其發(fā)現(xiàn)無脊椎動物血藍蛋白具有類酚氧化酶活性之后，本實驗室首次發(fā)現(xiàn)毛蚶Hb也具有類酚氧化酶活性，從此揭開了毛蚶Hb非特異性免疫功能研究的序幕。本研究擬利用生物化學和分子生物學手段從其血淋巴中分離純化出毛蚶Hb，鑒定其類酚氧化酶活性(PO-like activity)及其激活因子，確定其生物化學性質(zhì)和酶性質(zhì)，查清幾種常用免疫促進劑刺激以及細菌感染對毛蚶

3、Hb與血細胞的影響作用，克隆出毛蚶Hb的全長cDNA序列，并利用推測一級結(jié)構(gòu)氨基酸序列進行初步的同源性分析，旨在證實毛蚶Hb的非特異性免疫功能，為揭示毛蚶血紅蛋白在動物非特異性免疫中的作用及分子機理，鑒定其在呼吸蛋白家族中的分子進化地位等奠定基礎。 本文利用Sephacryl S-100凝膠過濾柱層析和Q sepharose Fast Flow離子交換柱層析技術(shù)成功從毛蚶血淋巴中分離純化出了血紅蛋白，并以L-二羥苯丙氨酸(L-D

4、OPA)為特異性底物對其類酚氧化酶活性進行了鑒定，實驗結(jié)果表明，所得毛蚶Hb純化樣品在SDS-PAGE電泳中為分子量約14.27 kDa的單一條帶，膠內(nèi)酶切肽指紋圖譜分析結(jié)果證實所得純化樣品確為Hb；同時，所得毛蚶Hb純化樣品對L-DOPA具有很強的氧化活性，且Native-PAGE電泳條帶的L-DOPA染色結(jié)果也證實其具有很強的氧化活性，表明毛蚶Hb確實具有類酚氧化酶活性。 生化性質(zhì)和酶性質(zhì)研究結(jié)果表明，毛蚶血紅蛋白純化樣品對

5、L-DOPA發(fā)揮類酚氧化酶活性的最適pH值為7.0、最適反應溫度為30℃，其Km值約為4.90mmol/L，且其類酚氧化酶活性可為異丙醇所進一步激活；不同氧化酶抑制劑的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毛蚶Hb純化樣品的類酚氧化酶活性對苯甲酸非常敏感，對抗壞血酸、亞硫酸鈉、檸檬酸和硫脲較為敏感，而對苯硫脲和半胱氨酸不敏感，表明毛蚶Hb發(fā)揮類酚氧化酶活性是具有酪氨酸酶類型的酚氧化酶性質(zhì)；此外，金屬離子螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)，Zn2+和Cu2+均能強烈

6、抑制毛蚶Hb純化樣品的類酚氧化酶活性，二乙基二硫氨基甲酸酯(DETC)、Ca2+和Mg2+的抑制作用較小，而Fe2+卻具有激活作用，說明毛蚶Hb的類酚氧化酶活性還具有金屬酶性質(zhì)；毛蚶Hb純化樣品類酚氧化酶活性的回復實驗結(jié)果顯示，被EDTA抑制的類酚氧化酶活性可特異性地為Fe2+所回復，進一步證明其是一種含鐵金屬酶性質(zhì)。綜上所述，毛蚶Hb發(fā)揮類酚氧化酶活性具有酪氨酸酶類型的含鐵酚氧化酶的性質(zhì)。 免疫促進劑處理毛蚶的實驗結(jié)果顯示，脂

7、多糖、β-葡聚糖、滅活哈維氏弧菌和滅活鰻弧菌處理48 h后，與對照組相比，毛蚶Hb的產(chǎn)量分別增加了7.47％、6.17％、10.39％和27.92％，其類酚氧化酶總活性分別增加了20.72％、4.03％、11.40％和45.84％，而單位酶活性沒有顯著差異，表明上述四種免疫促進劑的刺激可不同程度地提高毛蚶Hb的合成量及其類酚氧化酶總活性，其中以滅活鰻弧菌的刺激效果最為顯著；此外，脂多糖、β-葡聚糖、滅活哈維氏弧菌和滅活鰻弧菌處理48 h

8、后，毛蚶的血細胞的總數(shù)分別增加了8.3％、6.3％、2.0％和20.8％，表明上述四種免疫促進劑的刺激可不同程度地增加毛蚶血細胞的數(shù)量，其中以滅活鰻弧菌的刺激效果最為顯著。綜上所述，免疫促進劑脂多糖、β-葡聚糖、滅活哈維氏弧菌和滅活鰻弧菌可可不同程度地增加毛蚶血細胞的數(shù)量、提高毛蚶Hb的合成量及其類酚氧化酶總活性，暗示血細胞和血紅蛋白的確參與了免疫促進劑刺激下毛蚶自身免疫力的提高。 細菌感染毛蚶的實驗結(jié)果顯示，1×107個/mL

9、，鰻弧菌感染毛蚶48h后，與對照組相比，毛蚶Hb的產(chǎn)量增加了19.78％，類酚氧化酶總活性增加了5.29％，血細胞的總數(shù)卻減少了37.71％；1x108個/mL哈維氏弧菌感染毛蚶48h后，與對照組相比，毛蚶Hb的產(chǎn)量增加了8.44％，類酚氧化酶總活性增加了6.36％，血細胞的總數(shù)卻減少了1.75％；而濃度為1×105個/mL的哈維氏弧菌和鰻弧菌感染48h后毛蚶Hb的產(chǎn)量減少了1.99％和7.94％，類酚氧化酶總活性減少了1.15％和5.

10、59％，血細胞數(shù)量減少了35.63％和16.67％；上述結(jié)果表明，細菌感染能不同程度地引起毛蚶血細胞數(shù)量的減少，且高濃度細菌感染可不同程度地引起毛蚶Hb產(chǎn)量和類酚氧化酶總活性的增加，但低濃度細菌感染反而會不同程度地引起毛蚶Hb產(chǎn)量和類酚氧化酶總活性的降低，暗示血細胞和Hb的確參與了毛蚶的非特異性免疫反應。 從毛蚶血細胞中提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和快速擴增cDNA末端(RACE)技術(shù)，分別克隆出了毛

11、蚶血紅蛋白HbⅠ、HbⅡ A和HbⅡ B的全長cDNA序列，HbⅠ的cDNA全長為756 bp，編碼147個氨基酸殘基，分子量為16.2 kDa，與不等殼毛蚶(Scapharca inaequivalvis)HbⅠ的同源性為99.32％；HbⅡ A的cDNA全長為755 bp，編碼150個氨基酸殘基，分子量為16.5 kDa，與不等殼毛蚶(Scapharca inaequivalvis)HbⅡ-A鏈同源性為98.67％；HbⅡ B的cD