螺旋體的基因調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、螺旋菌會(huì)導(dǎo)致多種嚴(yán)重的疾病，如萊姆病，梅毒等。螺旋菌的致病機(jī)制復(fù)雜，很難研究。蒼白密螺旋體，又稱梅毒螺旋體（Treponema pallidum），是梅毒的病原體。由于其不能在體外培養(yǎng)，很難進(jìn)行體外的研究，所以致病機(jī)制至今不清。而伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi），是萊姆病的病原體，由于其可以在體外培養(yǎng)，所以致病因子調(diào)節(jié)通路已經(jīng)被廣泛研究。本研究首先針對(duì)伯氏疏螺旋體rrp2基因的功能進(jìn)行研究。在伯氏疏螺旋體的流動(dòng)周

2、期中，RpoN-RpoS通路對(duì)許多不同基因的表達(dá)起了至關(guān)重要的作用。RpoN-RpoS通路能夠被應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白(response regulator)/sigma-54依賴的刺激子（也稱作細(xì)菌增強(qiáng)子結(jié)合蛋白，bEBP）Rrp2激活。Rrp2除了激活RpoN-RpoS信號(hào)通路之外，還有另外一種功能:控制伯氏疏螺旋體的生長(zhǎng)。但是細(xì)菌的生長(zhǎng)并不需要RpoN-RpoS通路的存在。Rrp2是怎樣控制細(xì)菌生長(zhǎng)的？這一機(jī)制仍然需要探索。本研究中，通過(guò)構(gòu)

3、建一系列基因組rrp2部分敲除的條件敲除菌證明，Rrp2-N端對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)至關(guān)重要;接著發(fā)現(xiàn)，Rrp2氮端的D52磷酸化位點(diǎn)敲除導(dǎo)致伯氏疏螺旋體死亡，證明磷酸化位點(diǎn)與伯氏疏螺旋體的生存相關(guān)。Rrp2中央?yún)^(qū)域ATPase功能域（Rrp2-G239C）的突變株并沒(méi)有生長(zhǎng)缺陷，暗示著伯氏疏螺旋體的生長(zhǎng)并不是被Rrp2的磷酸化控制的sigma-54的激活作用而影響。我們進(jìn)一步地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲除碳端或者h(yuǎn)elix-turn-helix（HTH， DN

4、A結(jié)合功能域）功能域的最后16個(gè)氨基酸時(shí)，螺旋體不能生長(zhǎng)，證明有磷酸化控制的DNA結(jié)合作用與伯氏疏螺旋體的生存相關(guān)。由于過(guò)表達(dá)rpoS會(huì)導(dǎo)致伯氏疏螺旋體的死亡，接下來(lái)就證明了Rrp2敲除株的死亡并不是由于rpoS過(guò)表達(dá)的原因。這一部分的數(shù)據(jù)證明，Rrp2的磷酸化控制的寡聚化和DNA結(jié)合功能，很可能發(fā)揮著抑制子的作用，在伯氏疏螺旋體的生長(zhǎng)復(fù)制中發(fā)揮著非常重要的作用。此外，還發(fā)現(xiàn)，除了以上兩種作用，Rrp2還有第三種作用:在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)另

5、一轉(zhuǎn)錄因子，BosR。在伯氏疏螺旋體菌株中過(guò)表達(dá)Rrp2，發(fā)現(xiàn)BosR的水平明顯升高。定量PCR的結(jié)果證明，Rrp2是在轉(zhuǎn)錄的水平上調(diào)節(jié)BosR。
　　為了克服梅毒螺旋體不可以在體外培養(yǎng)這一缺點(diǎn)，利用體外可培養(yǎng)的伯氏疏螺旋體作為載體菌，將梅毒螺旋體的基因轉(zhuǎn)入相應(yīng)的伯氏疏螺旋體菌株進(jìn)行功能性表達(dá)，進(jìn)而對(duì)梅毒螺旋體的基因功能進(jìn)行研究。本研究中，構(gòu)建一個(gè)攜帶梅毒螺旋體基因tp0111的大腸桿菌-伯氏疏螺旋體穿梭質(zhì)粒，利用電轉(zhuǎn)化法，將質(zhì)粒

6、轉(zhuǎn)入相應(yīng)的伯氏疏螺旋體菌株中，通過(guò)觀察伯氏疏螺旋體的表型和相關(guān)基因表達(dá)變化，來(lái)研究梅毒螺旋體的基因功能。結(jié)果，成功地將梅毒螺旋體基因tp0111轉(zhuǎn)入伯氏疏螺旋體rpoN突變株內(nèi)之后發(fā)現(xiàn)，tp0111轉(zhuǎn)入株一定程度上回補(bǔ)了伯氏疏螺旋體突變株的表型缺陷，外膜蛋白OspC的表達(dá)量有明顯的恢復(fù)。結(jié)果證明，伯氏疏螺旋體可以作為載體來(lái)研究梅毒螺旋體的致病因子及其基因調(diào)控系統(tǒng)。由此我們可以推測(cè)梅毒螺旋體的致病因子，利用這一載體菌進(jìn)行新的研究，從而最終