OECs上清液誘導(dǎo)NSCs分化前后膜蛋白質(zhì)復(fù)合物的差異表達(dá)研究.pdf

1、第一章OECs培養(yǎng)及上清液對(duì)NSCs的誘導(dǎo)分化研究
　　 目的：探索小鼠嗅鞘細(xì)胞(olfactoryensheathingcells，OECs)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)分化的影響。
　　 方法：健康新生昆明小鼠10只，取大腦皮層組織，用含2％B27、1％N2、20ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)和20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(e

2、pidermalgrowthfactor，EGF)的培養(yǎng)液對(duì)NSCs進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，每5-7天傳代一次，純化培養(yǎng)2-3代備用，免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)NSCs進(jìn)行巢蛋白(Nestin)鑒定；取新生昆明小鼠嗅球，0.25%的胰蛋白酶37℃消化，改良Nash差速貼壁培養(yǎng)，加阿糖胞苷抑制雜細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到大約80%時(shí)吸出上清，加入新鮮培養(yǎng)基(無(wú)血清DMEM)，反復(fù)沖洗3遍，收集條件培養(yǎng)液，每隔3天半量換液。-20℃保存條件培養(yǎng)液，免疫細(xì)胞化學(xué)法

3、對(duì)OECs進(jìn)行神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體p75(nervegrowthfactorreceptorp75，NGFRp75)鑒定；實(shí)驗(yàn)組NSCs加OECs條件培養(yǎng)液及無(wú)血清DMEM/F12液培養(yǎng)，對(duì)照組NSCs只加無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔3天換液。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及分化情況，神經(jīng)絲蛋白200(neurofilament200，NF200)鑒定神經(jīng)元，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)鑒定

4、膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 結(jié)果：新生昆明小鼠大腦皮層中分離培養(yǎng)出NSCs，這些細(xì)胞具有長(zhǎng)期增殖能力，免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定顯示Nestin染色陽(yáng)性；新生昆明小鼠嗅球培養(yǎng)出OECs，7天NGFRp75染色見大量陽(yáng)性細(xì)胞；對(duì)照組NSCs克隆球少部分貼壁，未見增殖分化，細(xì)胞逐漸萎縮，12天時(shí)細(xì)胞死亡，實(shí)驗(yàn)組2天后NSCs克隆球開始貼壁分化，7天時(shí)分化較明顯，10天時(shí)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，NF200染色顯示NSCs克隆球大部分分化為神經(jīng)元，GFAP染色顯

5、示NSCs克隆球少部分分化為膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 結(jié)論：OECs上清液能誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元方向分化。
　　 第二章C17.2神經(jīng)干細(xì)胞膜蛋白質(zhì)復(fù)合物的研究
　　 目的：探索小鼠嗅鞘細(xì)胞(olfactoryensheathingcells，OECs)上清液誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)向神經(jīng)細(xì)胞分化的分子機(jī)制，篩選出誘導(dǎo)分化的關(guān)鍵蛋白，為臨床藥物靶向治療神經(jīng)損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　

6、 方法：取新生昆明小鼠嗅球，0.25%的胰蛋白酶37℃消化，改良Nash差速貼壁培養(yǎng)，加阿糖胞苷抑制雜細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到大約80%時(shí)吸出上清，加入新鮮培養(yǎng)基(無(wú)血清DMEM)，反復(fù)沖洗3遍，收集條件培養(yǎng)液，每隔3天半量換液，-20℃保存條件培養(yǎng)液。免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)OECs進(jìn)行神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體p75(nervegrowthfactorreceptorp75，NGFRp75)鑒定。C172.2小鼠神經(jīng)干細(xì)胞系復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代，37℃快

7、速融化、離心、吹勻，高糖改良Eagle培養(yǎng)基H-DMEM(含15%胎牛血清)培養(yǎng)，4-5天傳代一次，擴(kuò)增至第三代(P3)備用。實(shí)驗(yàn)組NSCs加OECs條件培養(yǎng)液及無(wú)血清DMEM液培養(yǎng)誘導(dǎo)分化1/2、1、4小時(shí)，對(duì)照組NSCs只加無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。應(yīng)用超速離心法提取細(xì)胞膜，藍(lán)綠溫和膠凝膠電泳(BlueNative-PAGE，BN-PAGE)分離膜蛋白質(zhì)復(fù)合物，膠內(nèi)酶切差異蛋白點(diǎn)，電噴霧四級(jí)桿時(shí)間飛行質(zhì)譜(ESI-Q-TOF-MS)

8、鑒定各時(shí)間點(diǎn)之間差異蛋白質(zhì)復(fù)合物的表達(dá)。將儀器自動(dòng)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)文件用Mascot軟件(www.matrixscience.com)中的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋(MS/MsIonSearch)功能進(jìn)行搜索。
　　 結(jié)果：新生小鼠嗅球培養(yǎng)出OECs，7天NGFRp75染色見大量陽(yáng)性細(xì)胞；C17.2NSCs復(fù)蘇后1天內(nèi)可見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)4-5天后細(xì)胞大量生長(zhǎng)，進(jìn)行傳代，傳代2天后可見大量細(xì)胞，形態(tài)呈梭形，折光性強(qiáng)；BN-PAGE顯示出11

9、個(gè)條帶，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)膠條酶切這11個(gè)條帶。ESI-Q-TOF-MS鑒定到79個(gè)肽段相匹配的蛋白質(zhì)，其中53個(gè)蛋白有顯著差別的表達(dá)，另外26個(gè)蛋白有相同豐度的表達(dá)。我們共鑒定到5個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合物的差異表達(dá)。
　　 結(jié)論：1.OECs上清液誘導(dǎo)NSCs分化前期的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)間膜蛋白質(zhì)復(fù)合物的表達(dá)有差異；
　　 2.我們發(fā)現(xiàn)5個(gè)差異蛋白質(zhì)復(fù)合物：mRNPgranulecomplex、ATPsynthasecomplex、eukary