sjTREC與年齡相關性及其法醫(yī)學意義的初步探討.pdf

1、在法醫(yī)物證實踐中,當法醫(yī)物證檢材如血液標本等不具備形態(tài)學信息時,根據(jù)分子生物學的方法可得到與年齡相關的一些有效信息。已有研究提出,多種生物學指標如端粒DNA限制性酶切片段(TRF)長度、線粒體DNA4977bp片段缺失程度、DNA甲基化水平等,均與個體年齡與衰老密切相關,可能是法醫(yī)學年齡推斷中的有效指標。目前,以上與個體年齡及衰老相關的生物學指標在法醫(yī)學年齡推斷中的應用研究分別取得了不同程度的進展,但大多數(shù)仍處于實驗階段,主要的問題是分

2、子生物學的觀測指標易受環(huán)境、遺傳和疾病等的影響,存在著人群和組織器官的差異等；單一指標與年齡之間缺乏精確的定量關系。鑒于此,法醫(yī)年齡推斷研究組(Study Group on Forensic Age Diagnostics)提出,對于每一份檢材,盡可能同時使用三種不同的非形態(tài)學的生物指標,以提高法醫(yī)物證檢材年齡推斷的準確性。因此,尋找更多與年齡相關性高、影響因素少的新指標,建立標準化與系統(tǒng)化的檢測方法,對提高生物檢材進行年齡推斷的準確性

3、具有重要的意義。
　　 隨著免疫學的長足發(fā)展,免疫系統(tǒng)結構和功能的增齡性變化規(guī)律以及在衰老過程中的作用也逐漸受到了研究者的普遍關注。作為中樞免疫器官,胸腺的增齡性功能退化是免疫系統(tǒng)在增齡和衰老過程中最突出的改變。定量分析外周血中特異的基因重排刪除產(chǎn)物-信號結合T細胞受體重排刪除環(huán)(Signal—joint Tcell recepter rearrangement excision circles,sjTRECs)水平是目前檢測胸

4、腺功能水平的可靠方法。研究證實,人外周血sjTRECs水平隨增齡按一定的規(guī)律下降,有可能是年齡推斷中的理想新指標。本課題以漢族健康無關個體為研究對象,擬建立一種簡便、靈敏、特異、重復性好的實時熒光定量檢測人外周血siTREC含量方法,用于構建正常人sjTREC水平的數(shù)據(jù)庫,為客觀評價胸腺輸出功能提供實驗依據(jù),并初步評價外周血sjTREC含量在年齡推斷中的潛在應用價值。
　　 本研究主要包括以下三個部分:
　　 第一部分:

5、實時定量PCR檢測sjTREC方法學建立
　　 目的:建立并優(yōu)化實時熒光定量PCR技術檢測人siTREC基因的方法。
　　 方法:設計并合成人sjTREC特異性引物與探針,使用TA克隆載體構建人sjTREC標準品,建立標準曲線。優(yōu)化實時定量PCR反應體系及熱循環(huán)參數(shù),并對所建立的實時定量PCR方法的特異性、靈敏度以及重復性進行方法學評價。
　　 結果:基因組DNA經(jīng)實時定量擴增后,可見清晰的擴增曲線,而陰性對照(

6、雙蒸水)未見明顯擴增曲線。成功構建了人sjTREC的重組質粒作為標準品,建立了標準曲線,所得標準曲線斜率為-3.544,相關系數(shù)為0.999189,PCR反應動力學范圍達6個log值(101-106),檢測下限為lOcopies；穩(wěn)定性檢測中,三種濃度不同的標準品的批內(nèi)變異和批間變異分別為0.09％、0.77％、1.68％和0.54％、1.88％、1.83％,均小于2％。
　　 結論:建立的實時熒光sjTREC定量方法對目的基因

7、DNA拷貝數(shù)進行PCR反應線性范圍廣、敏感性高、穩(wěn)定性好,可滿足后續(xù)實驗的要求。
　　 第二部分:實時熒光定量PCR檢測正常人外周血sjTREC含量的研究
　　 目的:本研究利用第一部分試驗中建立的sjTREC定量檢測方法,對各年齡組正常人外周血sjTREC的含量進行分析,初步建立正常人TRECs水平的數(shù)據(jù)庫。
　　 方法:使用試劑盒或酚/氯仿法提取收集的246例各年齡組健康人外周血基因組DNA樣本,利用第一部分

8、試驗中建立的sjTREC定量檢測方法,在ABI7500 PCR儀上實時擴增檢測各年齡組正常人外周血樣本中sjTREC片段,按照文獻介紹的方法計算每毫升血液中所含的sjTREC拷貝數(shù)(sjTREC/ml),結果取對數(shù)值。sjTREC含量與年齡的關系作相關分析；各年齡組性別差異作t檢驗。
　　 結果:246例健康人外周血樣本按照年齡分為14組(每隔5歲為1組)。sjTREC定量結果表明,外周血sjTREC水平隨年齡增長而逐漸下降,與

9、年齡呈顯著負性相關(r=0.8323,p<0.001),下降呈不均衡趨勢:10～14組與15～19組的LogsjTREC/mL值差值最大,15～54歲之間各組檢測值相差均較小,55～組以上與50～54組差值又相對較大。對0～14歲、15～54歲、55～歲三組進行方差分析,顯示三組間有顯著性差異(p<0.001)；均值多重比較結果(LSD檢驗)表明0～14歲與15～54歲組、15～54歲與55～歲組、0～14歲與55～歲組間的均值均有顯著

10、性差異(p<0.0001)；各年齡組男、女性外周血sjTREC水平均無顯著性差異(p>0.05)。定量結果受DNA抽提方法的影響。
　　 結論:使用實時熒光定量PCR方法,分析并提供了正常人各年齡組外周血中sjTREC含量,初步建立了正常人sjTREC水平的數(shù)據(jù)庫,為客觀評價胸腺輸出功能提供了依據(jù)。由于使用單一的外參照,定量結果受DNA抽提效率的影響,因此有必要同時應用內(nèi)標管家基因來標化結果并修正核酸抽提過程造成的目的基因拷貝數(shù)

11、的變化,以提高檢測的準確性。
　　 第三部分:人外周血sjTREC水平在年齡推斷應用中的初步研究
　　 目的:探討外周血sjTREC在年齡推斷應用中的潛在價值。
　　 方法:選擇人TATA盒結合蛋白(TATA box binding protein,TBP)基因作為內(nèi)參基因,設計并合成人TBP特異性引物與探針,使用TA克隆載體構建人TBP標準品,建立標準曲線。使用建立的實時熒光定量PCR反應系統(tǒng)對提取的248例各

12、年齡組健康人外周血樣本DNA中sjTREC和內(nèi)參基因TBP進行定量檢測,計算sjTREC與TBP的平均Ct值,并計算sjTREC/TBP比值,結果取對數(shù)值,以log(sjTREC/TBP)表示。log(sjTREC/TBP)值與年齡作相關及回歸分析；各年齡組性別差異作t檢驗。
　　 結果:248例外周血log(sjTREC/TBP)值含量隨年齡增長逐漸下降(r=-0.8177)；0～14歲內(nèi)外周血siTREC水平隨增齡下降的速度

13、較慢,14歲(青春期)開始下降速度加快,與胸腺開始萎縮的時間一致,之后在相當長的一段時間內(nèi)下降速度較緩,55歲開始又開始加快下降。對0～14歲、15～54歲及55～歲三組進行方差分析(LSD檢驗),顯示有顯著性差異(p<0.0001)；均值多重比較結果(LSD檢驗)表明0～14歲與15～54歲組、15～54歲與55～歲組、0～14歲與55～歲組間的均值均有顯著性差異(p

14、異(p>O.05)。得到推斷年齡的回歸方程為:Y=-24.921x-39.932±10.47(Y:供體年齡,歲；X:log(sjTREC/TBP)；±10.47:標準誤)；在所有被檢測的248例樣本中,162例(～66.0％)的年齡推測值與實際年齡誤差在10歲之內(nèi),其準確率與文獻報道的利用TRF長度推斷個體年齡的相似(49.5％的年齡實際值與推測值之間誤差小于10歲)。定量結果受DNA抽提效率的影響小。
　　 結論:使用內(nèi)參照基