魚類IL-1Ra-like基因的分子克隆和原核表達.pdf

1、Interleukin-1(IL-1)家族是一類多功能的細胞因子，目前在哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)了11個成員(IL-1F1～IL-1F11)，通過IL-1受體(IL-1 Receptor)家族發(fā)揮不同的生物學功能，參與啟動機體的免疫和炎癥反應，是脊椎動物中才出現(xiàn)的一類重要的免疫細胞因子。因此，在低等脊椎動物中對IL-1的研究對該家族的起源和進化有著非常重要的意義。IL-I家族中的IL-1F5，IL-1F10和IL-1 receptor anta

2、gonist(IL-1Ra)在進化樹上有著非常接近的關系，三者很可能起源于同一個IL-1Ra樣的祖先分子。而目前的研究發(fā)現(xiàn)IL-1F5與IL-1R家族的成員single immunoglobulinIL-1R related molecule(SIGIRR)有著密切的關系，實驗證實IL-1F5可能通過SIGIRR發(fā)揮免疫調控的作用。在魚類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了存在SIGIRR的同系物doubleimmunoglobulin IL-IR relat

3、ed molecule(DIGIRR)，但是至今在魚類或其他低等脊椎動物中都沒有發(fā)現(xiàn)除了1L-1β和IL-18之外的IL-1家族成員。
　　 本文運用生物信息學技術，成功地發(fā)現(xiàn)和克隆了魚類IL-1家族中的一個重要成員IL-1Ra-like(TnIL-1Ra-like)，進行了IL-1Ra-like的基因結構分析，系統(tǒng)進化分析、原核表達和蛋白純化研究。同時我們還預測了多種魚類中IL-IRa-like可能的受體分子DIGIRR基因，

4、構建了DIGIRR綠色熒光真核表達載體，并在HepG2細胞完成了DIGIRR-EGFP融合蛋白的表達。
　　 TnIL-1Ra-like cDNA ORF序列長591bp，TnIL-1Ra基因編碼由196個氨基酸組成、分子量為22.4kDa、pI為6.45的多肽。基因結構分析顯示TnIL-1Ra與哺乳動物中的IL-1Ra，IL-1F5及IL-1F10結構相似，都含有四個編碼外顯子，除第一個外顯子大小有所差異，其余三個外顯子都較一

5、致，提示三者較相近的進化關系。序列比對顯示TnlL-1 Ra-like與其它物種IL-1Ra，IL-1F5及IL-1F10之間的氨基酸有一定的相似度，但是物種間的差異較大，說明IL-IRa在進化中的保守程度不高。將TnlL-1 Ra-like的ORF亞克隆到原核表達載體pET28a上，得到重組載體TnlL-1Ra-like-pET28a，經(jīng)測序表明，目的基因序列及讀碼框均正確，表達載體構建成功。用IPTG誘導使表達菌株大量表達目的蛋白，