MicroRNAs調控胸部腫瘤中PLK1、BMI1和DAB2基因的分子機制及生物學功能的研究.pdf

1、目的：
　　肺癌和食管癌目前成為胸部腫瘤研究的熱點，在我國的發(fā)病率一直居高不下，尤其是近年來肺癌的發(fā)病率增長速度急劇增加，其中非小細胞肺癌（NSCLC）占85％以上。食管癌是原發(fā)于食管的惡性腫瘤，主要以食管鱗癌（ESCC）為主。肺癌與食管癌早期癥狀不明顯，絕大多數患者就診時已是中晚期，所以缺乏早期的診斷標記物是目前肺癌和食管癌高死亡率的主要原因。
　　Polo樣激酶1（Polo-like kinase1，PLK1）是一種細胞

2、周期調節(jié)分子，在有絲分裂過程中起重要作用。BMI1作為多梳基因家族的一種關鍵癌基因，參與細胞的自我更新和增殖，對調節(jié)上皮間質轉化（EMT）和促進腫瘤轉移具有重要作用。DAB2蛋白是一種廣泛表達的細胞內吞適配器，在多種細胞信號轉導中發(fā)揮主要作用，DAB2在多種癌癥中表達下降或缺失，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。
　　MicroRNAs（miRNAs）是一類短鏈非編碼RNAs，通過對基因轉錄后抑制調節(jié)基因的表達。許多研究表明mi

3、RNAs在非小細胞肺癌（NSCLC）和食管鱗癌（ESCC）中表達異常并在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。本課題旨在探討胸部腫瘤中PLK1、BMI1和DAB2異常表達的miRNAs調控機制，為胸部腫瘤的早期診斷和治療提供確鑿的實驗依據。
　　方法：
　　一．在非小細胞肺癌中miR-296-5p通過靶向調控PLK1抑制細胞增殖
　　1.運用生物信息學方法預測及驗證具有靶向調控PLK1的mircoRNAs
　　通過生物信

4、息學軟件 TargetScan、PicTar和 mirBase對直接調控 PLK1的mircoRNAs進行預測。查找 miR-296-5p的成熟體序列并合成 miR-296-5p的模擬體mimics瞬時轉染A549細胞，利用Western blot檢測轉染前后PLK1蛋白表達變化。預先將miR-296-5p mimics和含PLK1-3’UTR的雙熒光素酶報告載體共轉染NSCLC細胞，運用雙熒光素酶活性實驗檢測miR-296-5p是否與

5、PLK13’UTR區(qū)域的種子序列直接結合。
　　2. miR-296-5p通過靶向調控PLK1影響NSCLC細胞的生物學功能
　　用實時熒光定量 PCR（qPCR）的方法檢測臨床病人 NSCLC組織和癌旁組織中PLK1 mRNA和miR-296-5p的相對表達量。選取人正常支氣管上皮細胞HBE和5株肺癌細胞（A549、95C、95D、LTEP-α-2和H1299）用Western blot的方法檢測PLK1的蛋白表達水平，同

6、時用 qPCR方法檢測 miR-296-5p的相對表達量。用 miR-296-5p mimics和PLK1-siRNA分別轉染NSCLC細胞，通過CCK-8和EdU方法檢測上述基因對NSCLC細胞增殖的影響；
　　二．在非小細胞肺癌中miR-203通過靶向調控BMI1抑制細胞增殖和侵襲
　　1.運用生物信息學方法預測及驗證具有靶向調控BMI1的mircoRNAs
　　通過生物信息學軟件 TargetScan、PicTa

7、r和 mirBase對直接調控 BMI1的mircoRNAs進行預測。查找miR-203的成熟體序列并合成miR-203的模擬體mimics瞬時轉染LTEP-α-2細胞，利用Western blot檢測轉染前后BMI1蛋白表達變化。運用雙熒光素酶活性實驗檢測miR-203是否與BMI13’UTR區(qū)域的種子序列直接結合。
　　2. miR-203通過靶向調控BMI1影響NSCLC細胞的生物學功能
　　用實時熒光定量PCR（qP

8、CR）的方法檢測臨床病人NSCLC組織和癌旁組織中BMI1mRNA和miR-203的相對表達量。選取人正常支氣管上皮細胞HBE和6株肺癌細胞（A549、H1650、H226、H1299、H460和LTEP-α-2）用Western blot的方法檢測BMI1的蛋白表達水平。用 miR-203 mimics和 BMI1-siRNA分別轉染 NSCLC細胞，通過CCK-8和EdU方法檢測上述基因對NSCLC細胞增殖的影響。用Transwel

9、l試驗檢測miR-203和BMI1對NSCLC細胞侵襲能力的影響，流式細胞儀檢測miR-203和BMI1對NSCLC細胞凋亡的作用。
　　三．在食管鱗癌中miR-93通過靶向調控DAB2促進細胞增殖和侵襲
　　1.運用生物信息學方法預測及驗證具有靶向調控DAB2的mircoRNAs
　　通過生物信息學軟件TargetScan對直接調控DAB2的mircoRNAs進行預測。查找miR-93的成熟體序列并合成miR-93的

10、模擬體mimics瞬時轉染EC109細胞，利用Western blot檢測轉染前后 DAB2蛋白表達變化。運用雙熒光素酶活性實驗檢測miR-93是否與DAB2-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結合。
　　2.miR-93通過靶向調控DAB2影響ESCC細胞的生物學功能
　　用實時熒光定量 PCR（qPCR）的方法檢測臨床病人 NSCLC組織和癌旁組織中DAB2 mRNA和miR-93的相對表達量。用miR-93 mimics和D

11、AB2-siRNA分別轉染ESCC細胞，通過CCK-8和EdU方法檢測上述基因對ESCC細胞增殖的影響。流式細胞儀檢測miR-93和DAB2對ESCC細胞周期的影響。用Transwell試驗檢測miR-93和DAB2對ESCC細胞侵襲能力的影響。
　　四．在食管鱗癌中miR-218通過靶向調控BMI1抑制細胞增殖和遷移
　　1.運用生物信息學方法預測及驗證具有靶向調控BMI1的mircoRNAs
　　通過生物信息學軟件

12、 TargetScan、PicTar和 mirBase對直接調控 BMI1的mircoRNAs進行預測。查找miR-218的成熟體序列并合成miR-218的模擬體mimics瞬時轉染EC109細胞，利用Western blot檢測轉染前后BMI1蛋白表達變化。運用雙熒光素酶活性實驗檢測miR-218是否與BMI13’UTR區(qū)域的種子序列直接結合。
　　2. miR-218通過靶向調控BMI1影響ESCC細胞的生物學功能
　　

13、用實時熒光定量 PCR（qPCR）的方法檢測臨床病人 ESCC組織和癌旁組織中miR-218和BMI1mRNA的相對表達量。用正常食管上皮細胞（HEEC）作為對照，通過qPCR試驗檢測miR-218和BMI1 mRNA在ESCC細胞中的表達情況。用miR-218 mimics和BMI1-siRNA分別轉染ESCC細胞，通過CCK-8和EdU方法檢測上述基因對ESCC細胞增殖的影響。用Transwell試驗檢測miR-218和BMI1對E

14、SCC細胞遷移和侵襲能力的影響。流式細胞儀檢測miR-218和BMI1對ESCC細胞凋亡的作用。合成過表達BMI1（不含3’UTR）質粒，構建過表達BMI1的ESCC細胞株，轉染miR-218 mimics后，檢測BMI1蛋白表達量的變化及對細胞表型的影響。
　　結果：
　　一．在非小細胞肺癌中miR-296-5p通過靶向調控PLK1抑制細胞增殖
　　1．miR-296-5p靶向結合PLK1-3’UTR區(qū)域調控PLK1

15、的蛋白表達。
　　用miR-296-5p mimics轉染NSCLC細胞，Western blot顯示PLK1蛋白表達量較對照組明顯下降。運用生物信息學軟件預測miR-296-5p與PLK1-3’UTR的結合位點。用雙熒光素酶活性實驗檢測結果發(fā)現miR-296-5p與PLK1-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結合。
　　2. miR-296-5p通過靶向調控PLK1影響NSCLC細胞的生物學功能
　　在NSCLC組織中，P

16、LK1的mRNA表達水平較癌旁組織明顯升高（P<0.01），而miR-296-5p的表達水平較癌旁組織明顯下降（P<0.01）。與HBE細胞株相比PLK1的蛋白表達量在NSCLC細胞株中明顯上升，而miR-296-5p的表達量在NSCLC細胞株中均下降。用miR-296-5p mimics和PLK1-siRNA瞬時轉染NSCLC細胞株，通過CCK-8和EdU方法檢測細胞增殖，結果顯示過表達miR-296-5p和下調PLK1表達均能抑制N

17、SCLC細胞的增殖。
　　二．在非小細胞肺癌中miR-203通過靶向調控BMI1抑制細胞增殖和侵襲
　　1．miR-203靶向結合BMI1-3’UTR區(qū)域調控BMI1的蛋白表達。
　　用miR-203 mimics轉染NSCLC細胞，Western blot顯示BMI1蛋白表達量較對照組明顯下降。運用生物信息學軟件預測miR-203與BMI1-3’UTR的結合位點。用雙熒光素酶活性實驗檢測結果發(fā)現miR-203與BMI

18、1-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結合。
　　2. miR-203通過靶向調控BMI1影響NSCLC細胞的生物學功能
　　在NSCLC組織中 BMI1mRNA表達水平較癌旁組織明顯上升（P<0.01），而miR-203的表達水平較癌旁組織明顯下降（P<0.01）。與HBE細胞株相比BMI1的蛋白表達量在NSCLC細胞株中明顯上升。用miR-203 mimics和BMI1-siRNA瞬時轉染NSCLC細胞株，CCK-8和EdU方

19、法檢測細胞增殖，結果顯示過表達miR-203和下調BMI1表達均能抑制NSCLC細胞增殖。用miR-203 mimics和BMI1-siRNA瞬時轉染NSCLC細胞株，流式細胞儀檢測顯示過表達miR-203或下調BMI1的表達均能促進細胞凋亡。用miR-203 mimics和BMI1-siRNA瞬時轉染NSCLC細胞株，侵襲實驗表明過表達miR-203或下調BMI1表達均能抑制細胞侵襲能力。
　　三．在食管鱗癌中miR-93通過靶

20、向調控DAB2促進細胞增殖和侵襲
　　1. miR-93靶向結合DAB2-3’UTR區(qū)域調控DAB2的蛋白表達。
　　用miR-93 mimics轉染ESCC細胞，Western blot顯示DAB2蛋白表達量較對照組明顯下降。運用生物信息學軟件預測miR-93與DAB2-3’UTR的結合位點。用雙熒光素酶活性實驗檢測結果發(fā)現miR-93與DAB2-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結合。
　　2. miR-93通過靶向調控

21、DAB2影響ESCC細胞的生物學功能
　　在ESCC組織中 DAB2 mRNA表達水平較癌旁組織明顯下降（P<0.01），而miR-93的表達水平較癌旁組織明顯上升（P<0.05）。用miR-93 mimics和DAB2-siRNA瞬時轉染ESCC細胞株，CCK-8和EdU方法檢測細胞增殖，結果顯示過表達miR-93和下調DAB2表達均能促進ESCC細胞的增殖。用miR-93 mimics和DAB2-siRNA瞬時轉染ESCC細胞

22、株，流式細胞儀檢測顯示過表達miR-93或下調DAB2的表達均能促進細胞周期。用miR-93 mimics和DAB2-siRNA瞬時轉染ESCC細胞株，侵襲實驗表明過表達miR-93或下調DAB2表達均能促進細胞侵襲能力。
　　四．在食管鱗癌中miR-218通過靶向調控BMI1抑制細胞增殖和遷移
　　1．miR-218靶向結合BMI1-3’UTR區(qū)域調控BMI1的蛋白表達
　　用miR-218 mimics轉染ESCC

23、細胞，Western blot顯示BMI1蛋白表達量較對照組明顯下降。運用生物信息學軟件預測miR-218與BMI1-3’UTR的結合位點。用雙熒光素酶活性實驗檢測結果發(fā)現miR-218與BMI1-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結合。
　　2. miR-218通過靶向調控BMI1影響ESCC細胞的生物學功能
　　在ESCC組織中 miR-218表達水平較癌旁組織明顯下降（P<0.01），而BMI1 mRNA的表達水平較癌旁組織

24、明顯上升（P<0.01）。與HEEC細胞株相比miR-218表達量在ESCC細胞株中明顯下降。用miR-218mimics和BMI1-siRNA瞬時轉染ESCC細胞株，CCK-8和EdU方法檢測結果顯示過表達miR-218和下調BMI1表達均能抑制ESCC細胞的增殖；流式細胞儀檢測顯示過表達miR-218或下調BMI1的表達均能促進細胞凋亡；侵襲實驗表明過表達miR-218或下調BMI1的表達均能抑制細胞的侵襲能力。用miR-218 m

25、imics轉染過表達PLK1但不含3’UTR質粒的ESCC細胞株，Western blot顯示miR-218下調BMI1的蛋白表達，但這種下調結果可被轉染PLK1質?；謴?。同時miR-218誘導的抑制ESCC的細胞增殖、細胞劃痕和細胞侵襲的效果可被過表達PLK1的質?；謴汀?br>　　結論：
　　1. miR-296-5p通過靶向結合PLK1抑制NSCLC細胞的增殖。
　　2. miR-203通過靶向結合BMI1抑制NSCL