mRNA差異顯示技術(shù)在皮膚挫傷中的應(yīng)用.pdf

1、目的：運(yùn)用差異顯示技術(shù)結(jié)合銀染初步篩選大鼠皮膚挫傷后皮膚、肌肉的基因表達(dá)差異，旨在尋找一種或幾種與損傷相關(guān)的敏感基因，為法醫(yī)學(xué)病理學(xué)實(shí)踐中推斷時(shí)間提供科學(xué)、有效的參考依據(jù)。 方法：實(shí)驗(yàn)分為正常對照組(n=6)與實(shí)驗(yàn)損傷組(n=6)。實(shí)驗(yàn)損傷組：用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，常規(guī)手術(shù)消毒后，用250克重力錘在150cm高度自由落下，造成右后肢股四頭肌處皮膚、肌肉挫傷，于挫傷后4h將大鼠脫頸處死，于挫傷處取皮膚肌肉組織。正常對照組：

2、將大鼠脫頸處死，取相應(yīng)皮膚肌肉組織。提取對照組與損傷組的總RNA，經(jīng)質(zhì)量評(píng)價(jià)后，無降解的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。以4種錨定引物和3種隨機(jī)引物，共3×4=12種組合的非特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，初步篩選差異條帶。待確定正常組與損傷組有差異條帶之后，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8％的聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓400V、時(shí)間3h。對聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行固定、漂洗、染色、顯色、終止、漂洗。用無菌刀片切下差異條帶，進(jìn)

3、行2次擴(kuò)增。經(jīng)過TIANquick Maxi Purification Kit純化之后的擴(kuò)增產(chǎn)物與pMDl8－T Vector連接并轉(zhuǎn)染到JM109感受態(tài)細(xì)胞中，之后在SOC培養(yǎng)基、LB瓊脂平板培養(yǎng)基(Amp+)中進(jìn)行培養(yǎng)。挑選白色單菌落接種到含有Amp+LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，送菌液進(jìn)行測序，測序結(jié)果提交GenBank進(jìn)行對比。 結(jié)果：(1)實(shí)驗(yàn)組與對照組皮膚肌肉總RNA的質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求，其A260/A280值可達(dá)1.913

4、。(2)：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳后，實(shí)驗(yàn)組皮膚與肌肉與對照組比較出現(xiàn)差異條帶。(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8％的聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后實(shí)驗(yàn)組皮膚與肌肉出現(xiàn)差異條帶，差異條帶大約在150-600bp之間，總計(jì)22條差異條帶。(4)2次擴(kuò)增產(chǎn)物與pMDl8－T Vector連接并轉(zhuǎn)染到JM109感受態(tài)細(xì)胞中，LB瓊脂平板培養(yǎng)基(Amp+)中進(jìn)行培養(yǎng)。出現(xiàn)白色菌落與藍(lán)色菌落。(5)菌液進(jìn)行測序，測序結(jié)果提交GenBank進(jìn)

5、行對比，發(fā)現(xiàn)5個(gè)差異表達(dá)片段與GenBank的大鼠肌鈣蛋白、核酸結(jié)合蛋白、細(xì)胞色素c氧化酶、Rattus norvegicus myxovirus(influenza virus)resistance 2、Mouse DNA sequence from clone RP23-403G13有同源性，其余的差異條帶沒有同源性。 結(jié)論：大鼠皮膚損傷過程中有多種基因參與表達(dá)。肌鈣蛋白與細(xì)胞色素c氧化酶在損傷后，它們的mRNA表達(dá)均增加，