腐皮鐮孢菌殼聚糖酶CSN1的基因克隆、表達(dá)及其對(duì)致病性影響的研究.pdf

1、殼寡糖(Chitooligosaccharides)是由氨基葡萄糖以β-1,4-糖苷鍵縮合而成的低聚物,聚合度一般為2-20,具有較低的分子量,呈水溶性,易于被細(xì)胞吸收,具有多種生物學(xué)活性,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健、日化、農(nóng)業(yè)、生防等領(lǐng)域,有著廣闊的市場(chǎng)前景,是近年來研究和開發(fā)的熱點(diǎn)之一。
　　 殼寡糖主要由殼聚糖(Chitosan)降解產(chǎn)生,而殼聚糖是由自然界中儲(chǔ)量最為豐富的含氮類有機(jī)化合物甲殼素(Chitin)脫乙酰基形成的。目

2、前殼寡糖的制備方法主要有殼聚糖化學(xué)降解法和酶解法?；瘜W(xué)法包括濃酸降解法和過氧化氫降解法,但兩種方法都較難得到低聚合度的殼寡糖,而且反應(yīng)條件劇烈,容易引發(fā)環(huán)境問題。酶解法具有反應(yīng)條件溫和,殼寡糖得率高,不造成環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)。殼寡糖的酶法制備,又分為復(fù)合酶解法和專一性酶解法。復(fù)合酶解法是混合利用多種水解酶類,包括纖維素酶,蛋白酶,脂肪酶等,共同降解殼聚糖產(chǎn)生不同聚合度的殼寡糖。而專一性酶解法是利用殼聚糖的專一性水解酶一殼聚糖酶(Chitos

3、anase)水解殼聚糖制備殼寡糖的過程。從殼寡糖的轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)物分子量分布范圍、酶解產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性和酶解過程的可重復(fù)性來講,利用專一性酶解法制備殼寡糖最具有前景和發(fā)展優(yōu)勢(shì)。殼寡糖市場(chǎng)前景的廣闊促使了殼聚糖酶研究的活躍,目前已在多種微生物中分離到了殼聚糖酶,并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)、水解機(jī)制進(jìn)行了研究,其中以內(nèi)切型殼聚糖酶最適合于殼寡糖的生產(chǎn)。
　　 釀酒酵母是非常理想的真核生物表達(dá)系統(tǒng),具有原核細(xì)菌所沒有的真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)和

4、安全型基因工程受體系統(tǒng),并能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中,已廣泛用于外源基因的表達(dá)。釀酒酵母同時(shí)也是廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)微生物,具有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)迅速,便于大規(guī)模、高密度發(fā)酵,公認(rèn)的生物安全菌(GRAS),高抗逆性等優(yōu)良工業(yè)生產(chǎn)特性。
　　 腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)在世界范圍內(nèi)分布廣泛,可在土壤中長(zhǎng)期進(jìn)行腐生生活,同時(shí)也可寄生危害寄主植物。由于其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的嚴(yán)重危害,腐皮鐮孢菌受到了廣泛關(guān)注。Ha

5、dwiger(1980,1981)在研究F.solani與豌豆(Pisumsativum)的相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn),從F.solani細(xì)胞壁上釋放出的殼寡糖類能夠啟動(dòng)豌豆的防御機(jī)制,誘導(dǎo)豌豆細(xì)胞植保素(Phytoalexin)的產(chǎn)生,從而提高其抗病性,抑制F.solani的侵染,并通過免疫化學(xué)的方法檢測(cè)到殼寡糖從F.solani細(xì)胞壁上釋放出來,進(jìn)入植物細(xì)胞中。Prapagdee(2007)研究發(fā)現(xiàn)低濃度的外源性殼聚糖類就能夠抑制F.solan

6、i的生長(zhǎng),保護(hù)豌豆免于病原真菌引發(fā)的猝死綜合癥(Sudden death syndrome)。鑒于殼聚糖和殼寡糖在病原真菌與植物相互作用中扮演著重要的角色,Shimosaka(1993)曾推測(cè)F.solani殼聚糖酶可能與真菌細(xì)胞壁的降解或致病性有關(guān),但關(guān)于真菌殼聚糖晦生理功能的研究極少,至今尚沒有實(shí)驗(yàn)性的證據(jù)被報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期研究中利用平板透明圈法結(jié)合薄層層析法(TLC),篩選到一株能分泌表達(dá)殼聚糖酶的腐皮鐮孢菌F.

7、solani0114。對(duì)粗酶液的研究表明該菌所產(chǎn)殼聚糖酶的水解產(chǎn)物中不含單糖,水解產(chǎn)物的平均分子量為1.3kDa,殼寡糖比例較高。本論文的主要研究工作包括:1.F.solani殼聚糖酶基因的克隆及酶學(xué)性質(zhì)研究
　　 利用RT-PCR方法擴(kuò)增得到F.solani0114殼聚糖酶的cDNA序列,序列分析表明該cDNA中包含一個(gè)編碼300個(gè)氨基酸殘基的開放讀碼框(ORF,903bp)。該序列已提交至GeneBank,登錄號(hào)為EU263

8、917。將此序列N末端與His標(biāo)簽融合并在大腸桿菌DE3中異源表達(dá),通過對(duì)該重組酶的鎳柱純化,透析復(fù)性,得到了純化的殼聚糖酶CSN1。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示CSN1的分子量約為30kDa,酶學(xué)性質(zhì)分析表明CSN1的最適溫度為50℃,最適pH值為5.6,以脫乙酰度85％的殼聚糖為底物時(shí)Km值為0.063mg/ml,Vmax為126.58μmol/ml.min,比酶活為2.5U/mg。利用薄層層析法(TLC)和高效液相色譜技術(shù)(HPL

9、C)對(duì)CSN1的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析,結(jié)果表明,水解產(chǎn)物中不含單糖,10糖以下組分占75％以上,為內(nèi)切型殼聚糖酶。本研究得到的殼聚糖酶CSN1非常適合于殼寡糖的專一性酶解法生產(chǎn)。
　　 2.CSN1在釀酒酵母工業(yè)菌株中的表達(dá)
　　 將CSN1的cDNA序列與克魯維酵母的菊粉酶(INU1A)信號(hào)肽序列融合,以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的多拷貝整合性釀酒酵母表達(dá)載體pYMIKP質(zhì)粒為骨架,構(gòu)建得到CSN1表達(dá)質(zhì)粒pYMIKP-CHO,并將該

10、質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母N-27中,搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明,釀酒酵母重組菌株N-27C所產(chǎn)殼聚糖酶粗酶液的體積酶活達(dá)到50.2mU/ml,成功實(shí)現(xiàn)了CSN1在釀酒酵母中的分泌表達(dá),TLC法酶解產(chǎn)物分析表明,重組殼聚糖酶的酶解特性與純酶及F.solani0114所產(chǎn)殼聚糖酶相一致。釀酒酵母重組菌株的構(gòu)建對(duì)于CSN1的規(guī)模化生產(chǎn)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　 3.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的腐皮鐮孢菌轉(zhuǎn)化體系的建立
　　 選擇兩種轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記:潮酶素B(

11、Hygromycin B)和草丁磷除草劑(PPT)測(cè)定其對(duì)腐皮鐮孢菌孢子生長(zhǎng)的最低抑制濃度,結(jié)果顯示:400μg/ml潮霉素B或750μg/mlPPT能夠完全抑制F.solani0114孢子的萌發(fā)和生長(zhǎng)。以質(zhì)粒pCAMBIA1300為骨架,構(gòu)建適合腐皮鐮孢菌轉(zhuǎn)化的雙元載體pCABAR和pCAHPH,將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌LBA4404,利用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)(ATMT)轉(zhuǎn)化腐皮鐮孢菌F.solani0114。根據(jù)前期本實(shí)驗(yàn)室

12、對(duì)ATMT的研究結(jié)果,采用400μg/ml AS,6h預(yù)培養(yǎng)時(shí)間處理用于轉(zhuǎn)化的根瘤農(nóng)桿菌,根瘤農(nóng)桿菌與腐皮鐮孢菌孢子的共培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。并對(duì)根瘤農(nóng)桿菌與真菌孢子比進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果顯示根瘤農(nóng)桿菌與真菌孢子比為1.0/106·ml-1時(shí)轉(zhuǎn)化效果較好。測(cè)定了兩種選擇標(biāo)記:bar和hph對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果顯示以bar為選擇標(biāo)記時(shí),轉(zhuǎn)化效率為13轉(zhuǎn)化子/106孢子；以hph為選擇標(biāo)記時(shí),轉(zhuǎn)化效率為21轉(zhuǎn)化子/106孢子。與PEG-CalCl

13、2轉(zhuǎn)化法相比(27轉(zhuǎn)化子/107原生質(zhì)體),ATMT法具有較高的轉(zhuǎn)化效率,而且可以省略繁瑣的原生質(zhì)體制備與再生過程,操作更為簡(jiǎn)單。ATMT轉(zhuǎn)化體系的建立為下一步的F.solani功能基因研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.腐皮鐮孢菌CSN1超表達(dá)菌株和表達(dá)下調(diào)菌株的構(gòu)建
　　 以質(zhì)粒pCAMBIA1300為骨架,以勾巢曲霉(Aspergillus nidulans)強(qiáng)組成型啟動(dòng)子gpdA和終止子trpc,構(gòu)建帶有CSN1表達(dá)原件

14、的雙元載體pCHO。通過ATMT技術(shù)將pCHO轉(zhuǎn)入F.solani0114基因組中,構(gòu)建超表達(dá)CSN1的腐皮鐮孢菌。挑取12個(gè)陽性克隆進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明有5個(gè)克隆的殼聚糖酶體積酶活明顯增加,最高為出發(fā)菌株的2.1倍。
　　 根據(jù)CSN1 cDNA序列,對(duì)其mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行軟件分析,設(shè)計(jì)出兩個(gè)能自我配對(duì)形成帶有544bp莖和229nt環(huán)結(jié)構(gòu)的發(fā)夾片段。以CSN1 cDNA為模板,PCR擴(kuò)增得到兩個(gè)片段,將兩個(gè)片段反向連

15、接,形成反向重復(fù)序列(IR)。以質(zhì)粒pCAMBIA1300為骨架,構(gòu)建帶有IR轉(zhuǎn)錄原件的雙元載體pCIR,通過ATMT技術(shù)將pCIR轉(zhuǎn)入F.solani0114基因組中,構(gòu)建得到CSN1的RNA干擾(RNAi)菌株。利用平板透明圈法挑選到5株CSN1表達(dá)下調(diào)的菌株,Northernblot分析表明5株RNAi轉(zhuǎn)化子胞內(nèi)的CSN1 mRNA量與出發(fā)菌株相比明顯降低。
　　 5.腐皮鑲孢菌殼聚糖酶生理功能研究
　　 利用實(shí)時(shí)

16、熒光定量RT-PCR技術(shù)(qRT-PCR)檢測(cè)到F.solani0114在液體培養(yǎng)時(shí),CSN1主要在集中在菌體生長(zhǎng)的延滯期表達(dá),同時(shí)檢測(cè)到CSN1在F.solani0114對(duì)豌豆不同組織的侵染過程中也有明顯表達(dá)。表明殼聚糖酶可能不參與菌體的生長(zhǎng)過程,而與其致病性有關(guān)。對(duì)CSN1超表達(dá)菌株和RNAi菌株的生長(zhǎng)狀態(tài),致病能力進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示,與野生型菌株相比,CSN1超表達(dá)菌株在平板和液體培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)都受到了明顯的抑制,而RNAi菌株的

17、生長(zhǎng)較野生型無明顯變化。對(duì)三種菌進(jìn)行豆莢侵染測(cè)試,結(jié)果顯示:與野生型菌株相比,RNAi干涉菌株的侵染能力有明顯提高(>50％)；而CSN1超表達(dá)菌株的侵染能力明顯下降(<40％)。同時(shí),豆苗侵染測(cè)試結(jié)果也顯示RNAi菌株的毒性最高,野生型其次,CSN1超表達(dá)菌株的毒性最低,表明CSNl對(duì)F.solani的致病性有抑制作用。雖然CSN1對(duì)F.solani致病性的抑制機(jī)理有待于進(jìn)一步的研究,但關(guān)于該酶的生理功能是首次報(bào)導(dǎo),對(duì)于真菌殼聚糖酶的