透明顫菌血紅蛋白基因在蘇云金芽胞桿菌中的表達(dá)及對(duì)其發(fā)酵特性的影響.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bt)在發(fā)酵過(guò)程中需要消耗大量氧氣用以維持細(xì)胞正常代謝和殺蟲(chóng)蛋白的合成。透明顫菌血紅蛋白(VHb)是一種來(lái)源于原核生物的氧結(jié)合蛋白。本研究將透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)表達(dá)于Bt中，通過(guò)提高細(xì)胞對(duì)氧氣的利用能力，達(dá)到促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的目的。 1．本研究構(gòu)建了包含luxS啟動(dòng)子和vgb基因的整合載體pEG491-vgb<'+>，利用該載體，將vgb基因整合到Bt菌株BMB171的染色體上，構(gòu)建了菌株BMB1

2、71-VHb<'+>。再將攜帶cryIAc10基因的質(zhì)粒pHT304-Kan'-cry轉(zhuǎn)入BMB171VHb<'+>中，得到了菌株BMB667-VHb<'+>。vgb和crylAc10基因在BMB667-vHb<'+>中都得到了表達(dá)。同時(shí)構(gòu)建了不表達(dá)VHb的對(duì)照菌株BMB667-VHb<'->。 2．在高、中、低3種供氧條件的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，BMB667-VHb<'+>的細(xì)胞濃度(CFU)分別為對(duì)照菌株的0.94，1.23，和1.5

3、9倍；其晶體蛋白(ICP)產(chǎn)量分別為1.22，1.63和3.13倍；BMB667-VHb<'+>的ICP產(chǎn)量最大值出現(xiàn)也比對(duì)照菌株提前4-8 h。高、低兩種裝液量搖瓶發(fā)酵中，VHb表達(dá)菌株與對(duì)照相比，其對(duì)棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的LC<,50>值分別下降了36.6％和10.0％。 3．在臨界氧濃度(COC)實(shí)驗(yàn)中，臨界氧濃度最高出現(xiàn)在第4 h；第4 h時(shí)，BMB667-VHb<'+>的COC為12％，較對(duì)照菌株COC18％下降了33％。發(fā)酵過(guò)

4、程中，BMB667-VHb<'+>最大攝氧率(OuR)值達(dá)到68.6．mmol/Lh；較對(duì)照菌株的最大OUR值39.6 mmol/Lh提高73％；BMB667-VHb<'+>的最大呼吸強(qiáng)度(Q)為18.6 mmol/gh與對(duì)照的呼吸強(qiáng)度14.8 mmol/gh相比，有20.4％的增長(zhǎng)。在相同發(fā)酵條件下，VHb表達(dá)菌株和對(duì)照菌株分別攝取了通入氧氣量的3.1％和2.2％；VHb的表達(dá)菌株比對(duì)照菌株多利用了41％的氧氣。BMB667-

5、VHb<'+>和BMB667-VHb<'->的最大比生長(zhǎng)速率分別為0.783 h<'-1>和0.801 h<'-1>，葡萄糖半飽和常數(shù)分別為0.272g/L和0.297g/L。 4．本研究結(jié)果表明，vgb在Bt中表達(dá)以后，促進(jìn)了菌數(shù)和晶體產(chǎn)量的增長(zhǎng)，產(chǎn)物較菌數(shù)的增長(zhǎng)明顯，促進(jìn)效果隨著供氧條件的降低而增加。與氧代謝有關(guān)的菌株發(fā)酵特性也因vgb的表達(dá)而改變，COC、OuR和Q<,O2>都得到提高，這些發(fā)酵特性的改變?cè)鰪?qiáng)了菌株攝取氧氣