節(jié)桿菌和大腸桿菌海藻糖-6-磷酸合成酶在低溫下的催化效率比較.pdf

1、海藻糖是一種非還原性二糖分子，它可在干燥、脫水、熱脅迫、冷脅迫、氧化脅迫、滲透壓脅迫等多種脅迫環(huán)境下對生命體起保護(hù)作用，廣泛存在于除高等動物以外的生命體中。otsA/otsB途徑是生命體合成海藻糖的主要途徑，otsA基因編碼海藻糖-6-磷酸合成酶，它以葡萄糖-6-磷酸和UDP-葡萄糖作為底物，生成海藻糖-6-磷酸和UDP。OtsB催化海藻糖-6-磷酸生成海藻糖。UDP-葡萄糖在冷信號傳導(dǎo)中起重要作用，海藻糖-6-磷酸調(diào)控著體內(nèi)糖的代謝，

2、都對生命體在逆境中的存活與生長起重要作用，它們分別是OtsA的底物和產(chǎn)物，因此研究不同生長環(huán)境中的生命體的OtsA催化效率具有重要意義。 本實驗所用實驗材料為節(jié)桿菌和大腸桿菌，此株節(jié)桿菌為耐冷菌，其OtsA與中溫菌大腸桿菌的OtsA作酶動力學(xué)比較，通過不同溫度下一系列酶學(xué)參數(shù)的分析，得出節(jié)桿菌OtsA在低溫下較之大腸桿菌的優(yōu)越性，從而為研究耐冷菌的耐冷機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出大腸桿菌和節(jié)桿菌中的otsA基因，

3、連接入T載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，再用限制性內(nèi)切酶將基因片段切下，連接入pET表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)后，工程菌大量表達(dá)重組蛋白。利用親和層析法分離純化目的蛋白，并對其催化活性進(jìn)行測定。 通過分析對比低溫下不同物種間OtsA的催化效率，得出節(jié)桿菌的OtsA比大腸桿菌的更適應(yīng)低溫環(huán)境，這個適應(yīng)性主要取決于對UDP-葡萄糖的親和度(體現(xiàn)在米氏常數(shù)Km上)，而不取決于酶的轉(zhuǎn)換數(shù)(Kcat)。溫度由30℃