桑辛素通過下調(diào)c‐Myc的表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞的增殖和腫瘤生長.pdf

1、近年來盡管胃癌的發(fā)病率有所降低，但是其依舊是世界上患者最多的癌癥之一。在發(fā)展中國家中，胃癌是致死率最高的三種癌癥之一，每年約有十萬胃癌新生病人。雖然我們?cè)谖赴┑姆呕煼矫嫒〉昧藰O大的進(jìn)步，但是胃癌病人的預(yù)后情況依舊不理想，平均五年的生存率不到30%。因此，篩選有效的胃癌藥物，對(duì)于提高胃癌病人的治療效果及生存率擁有非凡的意義。黃酮類化合物包括黃酮、黃烷酮、異黃酮、二氫異黃酮、二氫查爾酮等幾大類，據(jù)報(bào)道黃酮類化合物具有抗腫瘤活性。比如，黃芩

2、素作為一種派生類黃酮，擁有多種不同的生物活性，其可以誘導(dǎo)膀胱癌的凋亡，同時(shí)還可以抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。另外黃酮前體查爾酮可以通過抑制NF-κB的活性從而抑制胃癌細(xì)胞的生長，同時(shí)可以上調(diào)DR4和DR5的表達(dá)，從而引起結(jié)腸癌和肝癌的凋亡。桑辛素作為一種桑白皮（桑樹根部的皮）富含的黃酮類化合物，據(jù)報(bào)道其可以通過抑制NF-κB的活性來誘導(dǎo)宮頸癌和結(jié)腸癌的凋亡。同時(shí)能夠通過調(diào)節(jié)EGFR及DR5的活性，來誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。不僅如此，同時(shí)桑

3、辛素能夠抑制STAT3的活性，從而誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的死亡。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴使用不同濃度的桑辛素對(duì)兩種胃癌細(xì)胞系（MKN45及SGC7901）進(jìn)行處理后，細(xì)胞增殖率結(jié)果顯示，桑辛素顯著地抑制了胃癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)MTT實(shí)驗(yàn)及BrdU實(shí)驗(yàn)也得到了同樣的結(jié)果。為探索桑辛素抑制胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，進(jìn)行了細(xì)胞周期分析，結(jié)果顯示桑辛素可以將胃癌細(xì)胞阻滯在 G1期。同時(shí)為了探索桑辛素阻滯細(xì)胞周期的分子機(jī)制，通過 western bl

4、ot實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)桑辛素下調(diào)了CDK2，CDK4，Cyclin D1以及Cyclin E1的表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桑辛素可以下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞增殖。⑵為探索桑辛素對(duì)胃癌細(xì)胞體外成瘤的影響，我們進(jìn)行了Soft Agar實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示相對(duì)于對(duì)照組而言，桑辛素處理組克隆數(shù)目較少且體積較小，桑辛素抑制了胃癌細(xì)胞體外成瘤。同時(shí)進(jìn)行了小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)，對(duì)腫瘤生長情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

5、發(fā)現(xiàn)，桑辛素顯著抑制了腫瘤的生長。對(duì)各組腫瘤進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果顯示桑辛素處理組生長標(biāo)志物Ki67陽性細(xì)胞率顯著下降。對(duì)CDK2，CDK4，Cyclin D1以及Cyclin E1在腫瘤中的表達(dá)情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，四種周期蛋白表達(dá)均顯著降低。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無論在體內(nèi)還是體外，桑辛素均可通過阻滯細(xì)胞周期來抑制腫瘤的生長。⑶Western blot實(shí)驗(yàn)表明桑辛素可以下調(diào)c-Myc的表達(dá)，并且這種下調(diào)作用有時(shí)間和濃度的依耐性，免疫組化分析

6、也表明桑辛素可以抑制c-Myc在腫瘤內(nèi)的表達(dá)。為了研究c-Myc在桑辛素調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖中的作用，我們構(gòu)建了 c-Myc過表達(dá)的胃癌細(xì)胞系。對(duì)正常的胃癌細(xì)胞系和過表達(dá)c-Myc細(xì)胞系進(jìn)行藥物處理后，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，c-Myc可以減緩桑辛素對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用。在c-Myc過表達(dá)的細(xì)胞系中，四種細(xì)胞周期蛋白（CDK2，CDK4，Cyclin D1以及Cyclin E1）的表達(dá)均有不同程度的上調(diào)。由于c-Myc是通過識(shí)別“E-box”序

7、列，從而結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子上來調(diào)控下游基因的表達(dá)，為研究c-Myc是否結(jié)合到CDK2，CDK4，Cyclin D1以及Cyclin E1的啟動(dòng)子上，我們進(jìn)行了ChIP實(shí)驗(yàn)。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明c-Myc可以通過識(shí)別“E-box”序列，從而結(jié)合到CDK4，Cyclin D1以及Cyclin E1的啟動(dòng)子上。雖然CDK2啟動(dòng)上也存在“E-box”序列，但是我們的結(jié)果并沒有發(fā)現(xiàn)c-Myc可以結(jié)合到CDK2的啟動(dòng)子。綜上所述，桑辛素通過下調(diào)c

8、-Myc的表達(dá)來抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。⑷提出假設(shè)：桑辛素通過下調(diào) c-Myc的表達(dá)來抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。為了驗(yàn)證我們的假設(shè)，在過表達(dá) c-Myc和正常的胃癌細(xì)胞添加桑辛素處理后，進(jìn)行細(xì)胞周期分析，結(jié)果顯示過表達(dá)c-Myc可以顯著降低處于G1期的細(xì)胞比例。western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在桑辛素處理后，過表達(dá)c-Myc細(xì)胞系相對(duì)于對(duì)照組而言，CDKs以Cyclins的表達(dá)量都相對(duì)較高，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá) c-Myc可以減緩

9、桑辛素對(duì)胃癌細(xì)胞細(xì)胞周期的阻滯。我們發(fā)現(xiàn)桑辛素可以顯著抑制c-Myc的表達(dá)，且原癌基因c-Myc在腫瘤發(fā)生和生長方面發(fā)揮著重要的作用，所以在對(duì)過表達(dá)c-Myc的細(xì)胞系和正常胃癌細(xì)胞系進(jìn)行藥物處理后，在體外我們檢測(cè)了各組細(xì)胞的成瘤能力，結(jié)果表明過表達(dá)c-Myc的細(xì)胞系相對(duì)于對(duì)照組而言，成瘤數(shù)目有顯著的提升。小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)也表明，過表達(dá)c-Myc可以減緩桑辛素對(duì)腫瘤生長的抑制作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明桑辛素通過下調(diào)c-Myc的表達(dá)來抑制細(xì)胞周期