細菌磁小體在體外免疫檢測和基因傳遞中的應用.pdf

1、細菌磁小體(BMPs)是趨磁細菌細胞內(nèi)合成的磁性納米顆粒，其組成為Fe<,3>O<,4>的晶體以脂膜包被。磁小體具有優(yōu)良載體的性質(zhì)，分別在固定化酶、吸附核酸用于基因槍彈、連接抗體進行免疫檢測和載藥后進行靶向治療腫瘤等方面，具有廣闊的應用前景。 本室的前期研究已經(jīng)解決了趨磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense)的深層培養(yǎng)問題，細胞的培養(yǎng)水平高于目前報道的5倍以上。本論文對純化磁小體的多種方法進行比

2、較，證明了細胞壓榨機對細胞的破碎效果優(yōu)于超聲波，一次(1000 psi)可破碎90％的細胞，而在后續(xù)的洗滌步驟中，只需采用超聲波輕微擊打，配合磁鐵吸附回收，即可獲得純凈的磁小體。純化的磁小體分別經(jīng)電鏡、紅外和能譜進行檢測。電鏡觀察表明，純化磁小體的晶型穩(wěn)定，顆粒均勻，直徑多在25～45nm，外膜完整；不同批次純化的磁小體在PBS緩沖體系(pH 7.4)中的紅外檢測波峰分布一致，能譜檢測結(jié)果顯示純化的磁小體含有C、O、Fe、P、N等元素，

3、無其他雜質(zhì)存在，配合生化方法檢測，建立了純凈磁小體標準紅外譜圖，并建議將其作為批量生產(chǎn)的檢測標準。 比較并摸索了多種磁小體的滅菌方法，實驗結(jié)果證明，r-射線滅菌是一種簡便有效的手段。經(jīng)MTT實驗證明，滅菌后的磁小體對小鼠纖維原細胞L-929無毒害，利用家兔法證明純凈磁小體不含內(nèi)毒素，可以將磁小體作為載體應用到細胞和動物體內(nèi)的實驗中。 通過優(yōu)化磁小體與乙肝表面抗原抗體的連接方法，使連接效率提高到527μg抗體/mg磁小體。

4、選用辣根過氧化物酶系統(tǒng)結(jié)合化學發(fā)光，用雙抗體夾心法檢測乙肝表面抗原，檢測限可達到0.1ng/ml，靈敏度比酶免方法提高了5倍。通過對臨床109份血清樣本的檢測，結(jié)果與酶免的方法100％吻合，說明該方法可以應用到臨床樣本的檢測中。 利用聚乙烯亞胺(PEI)將BMPs和DNA連接形成復合物，進行體外細胞轉(zhuǎn)染及動物體內(nèi)基因傳遞實驗，結(jié)果證實BMPs-PEI體系不僅能有效地將DNA遞送到細胞內(nèi)和動物體內(nèi)并正常表達，也可作為核酸疫苗的增強

5、劑而極大地刺激體內(nèi)的免疫反應。當PEI與DNA的N/P比為8時，BMPs-PEI能達到較佳的轉(zhuǎn)染效果；當N/P為8時，BMPs與DNA的質(zhì)量比在0.5:1時轉(zhuǎn)染效率可以達到最高。當BMPs存在時，BMPs-PEUDNA復合物可以抵御DNase-I的“消化”作用。在磁場的作用下，BMP-PEI/DNA能加速到達細胞的表面促進質(zhì)粒DNA進入細胞。BMPs-PEI之所以能起到提高轉(zhuǎn)染效率的作用，可能的原因是該系統(tǒng)具備滲透溶酶體的能力，促使目的

6、DNA順利到達細胞核內(nèi)。BMPs-PEI和BMPs-PEI/DNA復合物對細胞幾乎沒有毒性。這是因為BMPs的膜上本身帶有負電荷，可以中和一部分PEI上的正電荷，從而減輕對細胞的傷害。在磁場的作用下BMPs-PEI系統(tǒng)能明顯增強β-半乳糖苷酶在體內(nèi)的表達水平。以口蹄疫病毒核酸疫苗為實驗材料，檢測了BMPs-PEI在體內(nèi)引起細胞免疫和體液免疫的水平，在磁場的作用下，該系統(tǒng)能顯著增強機體免疫應答水平。因此，BMPs-PEI可以作為一種新型的