miR-21通過RECK介導(dǎo)TGF-β1引起的肝卵圓細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、目的:
　　肝纖維化前期的研究表明與肝星狀細(xì)胞的激活有關(guān)，現(xiàn)在表明上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)也起著非常重要的作用。EMT表現(xiàn)為上皮標(biāo)志的蛋白標(biāo)志物降低和間皮標(biāo)志蛋白標(biāo)志物的表達(dá)升高。microRNA是一類含25個核苷酸左右的非編碼RNA，通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)與靶基因的mRNA的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)特異性結(jié)合后，抑制其轉(zhuǎn)錄和翻譯，在多種生物過程中發(fā)揮重要作用。肝

2、卵圓細(xì)胞（Hepatic oval cell，HOC）是肝臟的原始兼性多能干細(xì)胞，肝卵圓細(xì)胞具備極強(qiáng)的體外增殖和分化能力，在肝臟嚴(yán)重?fù)p傷或者肝臟受到肝毒性物質(zhì)損傷時候，這時候卵圓細(xì)胞的增殖與分化來完成肝再生。本研究的目的是探討miR-21在大鼠肝卵圓細(xì)胞(WB-F344) EMT中的作用和機(jī)理。
　　方法：
　　1.TGF-β1對大鼠肝卵圓細(xì)胞EMT的作用
　　用10ng/ml TGF-β1刺激HOC1、3、5、7天后

3、，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，western blot檢測上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin和間皮標(biāo)志蛋白(N-cadherin、Vimentin)的表達(dá)。
　　2.TGF-β1刺激miR-21的表達(dá)
　　用10ng/ml TGF-β1刺激HOC5天后，實時熒光定量PCR檢測miR-21的表達(dá)情況。
　　3.MiR-21介導(dǎo)了TGF-β1對HOC的EMT作用
　　轉(zhuǎn)染100 MOI miR-21抑制慢病毒(anti

4、-miR-21)抑制miR-21的表達(dá)后，用實時熒光定量PCR檢測miR-21的表達(dá)情況。建立穩(wěn)定的miR-21抑制慢病毒細(xì)胞株后，用TGF-β1刺激HOC5天，western blot檢測檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)。
　　4.MiR-21對大鼠肝卵圓細(xì)胞EMT的作用
　　用100 MOI miR-21增強(qiáng)慢病毒(pre-miR-21)轉(zhuǎn)染HOC，用實時熒光定量PCR檢測miR-2

5、1的表達(dá)情況。建立穩(wěn)定的miR-21增強(qiáng)慢病毒細(xì)胞株后，用TGF-β1刺激HOC5天，western blot檢測檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)。
　　5.RECK介導(dǎo)了大鼠肝卵圓細(xì)胞的EMT
　　(1) TGF-β1刺激細(xì)胞后，westem blot檢測蛋白RECK。
　　(2)用TGF-β1刺激已轉(zhuǎn)染終濃度為100 MOI的miR-21抑制慢病毒的細(xì)胞5天后，用western

6、 blot檢測PTEN的表達(dá)量。
　　(3)轉(zhuǎn)染終濃度為100 MOI的miR-21增強(qiáng)慢病毒4天后，用western blot檢測RECK的表達(dá)量
　　(4)用RECK siRNA轉(zhuǎn)染大鼠肝卵圓細(xì)胞后，TGF-β1刺激細(xì)胞5天。用westemblot檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)。
　　(5)用RECK siRNA轉(zhuǎn)染大鼠肝卵圓細(xì)胞后，miR-21增強(qiáng)慢病毒轉(zhuǎn)染HOC。用wes

7、tern blot檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.TGF-β1的刺激引起大鼠肝卵圓細(xì)胞發(fā)生EMT
　　(1)TGF-β1刺激細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，由原先卵圓形變?yōu)榧?xì)梭形樣的成纖維細(xì)胞狀細(xì)胞。
　　(2)TGF-β1刺激引起了上皮標(biāo)志蛋白(E-鈣粘蛋白)表達(dá)下降。
　　(3)TGF-β1刺激引起了間質(zhì)標(biāo)志蛋白（N-鈣粘蛋白、波形蛋白）表達(dá)上升。

8、　　2.TGF-β1刺激大鼠肝卵圓細(xì)胞miR-21的表達(dá):在TGF-β1刺激5天后miR-21的表達(dá)明顯上升。
　　3.MiR-21介導(dǎo)了TGF-β1對HOC的致EMT作用。
　　(1)轉(zhuǎn)染miR-21抑制慢病毒穩(wěn)定細(xì)胞株后，miR-21的表達(dá)明顯下降。
　　(2)上皮標(biāo)志蛋白（E-鈣粘蛋白）較對照組表達(dá)升高。
　　(3)間質(zhì)標(biāo)志蛋白（N-鈣粘蛋白、波形蛋白）表達(dá)較對照組表達(dá)下降。以上結(jié)果提示下調(diào)miR-21表達(dá)

9、后，阻斷了TGF-β1致HOC的EMT作用。4.miR-21轉(zhuǎn)染直接刺激HOC發(fā)生EMT
　　(1)轉(zhuǎn)染miR-21增強(qiáng)慢病毒穩(wěn)定細(xì)胞株后，miR-21的表達(dá)明顯增高。
　　(2)miR-21增強(qiáng)轉(zhuǎn)染組較對照組相比上皮標(biāo)志蛋白（E-鈣粘蛋白）表達(dá)下降。
　　(3)miR-21增強(qiáng)轉(zhuǎn)染組較對照組相比間質(zhì)標(biāo)志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)表達(dá)較對照組升高。以上結(jié)果提示miR-21過表達(dá)可直接刺激HOC發(fā)生EMT
　　

10、5.RECK介導(dǎo)了HOC的EMT
　　(1)TGF-β1調(diào)節(jié)了RECK蛋白的表達(dá):TGF-β1刺激細(xì)胞后RECK表達(dá)下降。
　　(2)miR-21調(diào)節(jié)了PTEN蛋白的表達(dá):TGF-β1+anti-miR-21組較單純TGF-β1組RECK表達(dá)上升，Pre-miR-21組較陰性對照組RECK表達(dá)下降。
　　(3)抑制RECK增加了TGF-β1的EMT作用:RECK siRNA+TGF-β1組較TGF-β1組上皮標(biāo)志蛋白(