轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子在砷誘導(dǎo)的人類HaCaT細(xì)胞抗氧化反應(yīng)和細(xì)胞毒性中作用的研究.pdf

1、前言：
　　 砷是一種廣泛存在的環(huán)境毒物,可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),包括無機(jī)砷和有機(jī)砷。人類砷暴露主要是飲用含砷的地下水源或者醫(yī)用含砷藥物導(dǎo)致。砷是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中經(jīng)常涉及的一種毒物,由于急性砷中毒的癥狀不明顯或慢性砷中毒的毒物檢出量很低,所以研究砷暴露對(duì)人體的損害及其機(jī)制也會(huì)為砷中毒的法醫(yī)學(xué)鑒定提供證據(jù)。當(dāng)人類長(zhǎng)期暴露于無機(jī)砷后,會(huì)出現(xiàn)多種疾病,包括多臟器腫瘤、高血壓、糖尿病和皮膚損害。砷暴露致皮膚損害的類型包括良性的皮膚色素

2、代謝異常和皮膚過度角化,惡性病變包括皮膚Bowen氏病和皮膚的惡性腫瘤。盡管砷是明確的皮膚毒物,但砷致皮膚損害的機(jī)制尚不清楚。前期的研究表明砷可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)并可導(dǎo)致氧化性DNA損傷。因此砷致皮膚損害的機(jī)制很可能與細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子是CNC家族成員之一,包括NRF1、NRF2和NRF3,這些轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)引發(fā)的細(xì)胞適應(yīng)性變化過程中發(fā)揮重要作用。因此,本研究旨在探討NRFs在砷致體外

3、培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞抗氧化反應(yīng)和細(xì)胞毒性中的作用及其機(jī)制,從而闡明砷致皮膚損害的機(jī)制,為預(yù)防和治療砷致皮膚過度角化和皮肽癌提供理論依據(jù),同時(shí)探討NRFs在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中鑒定砷中毒的應(yīng)用價(jià)值。
　　 方法：
　　 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用慢病毒為載體的sh-RNA,在體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞中制作NRF1、NRF2、NRF3和KEAP1選擇性基因沉默(knockdown,KD)的細(xì)胞模型,應(yīng)用qRealtime RT-PCR和Wester

4、n blotting技術(shù)觀察砷暴露條件下NRFs、KEAP1和一系列ARE目的基因表達(dá),觀察選擇性基因沉默的細(xì)胞內(nèi)ARE目的基因表達(dá)的變化,探討NRFs的激活機(jī)制和對(duì)ARE目的基因的調(diào)控作用,同時(shí)應(yīng)用MTT方法和流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)選擇性基因沉默的細(xì)胞對(duì)砷誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的反應(yīng)變化,從而闡明NRFs在砷誘導(dǎo)的細(xì)胞抗氧化反應(yīng)過程中的作用。此外,應(yīng)用熒光素酶活性檢測(cè)試劑(Luciferase Activity)觀察砷對(duì)HaCaT細(xì)胞內(nèi)的ARE活

5、性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明慢性砷暴露導(dǎo)致的典型皮膚病理學(xué)改變有助于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中判定慢性砷中毒。MTT和流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,在體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞內(nèi),NRF2的沉默明顯增強(qiáng)砷誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性,KEAP1是NRF2的抑制因子,該分子沉默的細(xì)胞表現(xiàn)出明顯拮抗效應(yīng)。然而,NRF1的沉默也可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)砷誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的敏感性,但其程度較NRF2沉默的細(xì)胞弱。NRF3的基因沉默細(xì)胞對(duì)砷誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性沒有

6、明顯變化。為了探討其機(jī)制,在砷暴露的條件下,我們對(duì)NRFs的表達(dá)和一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因,如NQO1、GCLC、GCLM、HMOX-1、SRX等基因進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明砷和其他的NRF2的激活因子(如tBHO和Sulforaphane)不同,砷不僅可以激活NRF2還可以激活NRF1的表達(dá),而且存在明顯的時(shí)間和劑量效應(yīng)。NRF1是在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)發(fā)生糖基化的蛋白。糖基化的過程明顯影響砷對(duì)ARE活性的激活。砷可以激活NRF1并引起NRF

7、1的核內(nèi)聚集,實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示過糖基化和非糖基化的蛋白仍可以轉(zhuǎn)錄到核內(nèi)。NRF1在細(xì)胞內(nèi)通過調(diào)控GCLC和GCLM的表達(dá)而影響細(xì)胞內(nèi)GSH水平,另外NRF1還可以調(diào)控NQO1的表達(dá),但NRF1對(duì)細(xì)胞內(nèi)HMOX-1的表達(dá)幾乎沒有影響。砷暴露對(duì)NRF2的激活作用很明顯,低劑量的砷即可激活細(xì)胞內(nèi)NRF2的表達(dá),而且NRF2可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)NQO1、HMOX-1、GCLC、GCLM和SRX等ARE基因的表達(dá),從而對(duì)砷誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)作用。K

8、EAP1作為NRF2的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,其沉默后在正常生理狀態(tài)下,上調(diào)NRF2的表達(dá)并調(diào)控ARE相關(guān)基因的表達(dá)增強(qiáng),但該分子的沉默并不能導(dǎo)致砷誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ARE相關(guān)基因表達(dá)的進(jìn)一步增加,說明KEAP1對(duì)NRF2的調(diào)控作用非常顯著。值得提出的是KEAP1的沉默可下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HMOX-1的表達(dá),說明細(xì)胞內(nèi)HMOX-1表達(dá)的調(diào)控存在復(fù)雜的機(jī)制。砷暴露可導(dǎo)致NRF3的基因表達(dá)變化,但NRF3的基因沉默并未引起細(xì)胞對(duì)砷誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和抗氧化反應(yīng)的異常,

9、而且NRF3對(duì)ARE目的基因的表達(dá)基本沒有調(diào)控作用。在我們針對(duì)選擇性基因沉默細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),NRFs和KEAP1之間存在復(fù)雜的相互作用和調(diào)控機(jī)制。在三價(jià)無機(jī)砷暴露的情況下,NRF1的沉默并不影響細(xì)胞內(nèi)NRF2的表達(dá)水平,但在該細(xì)胞內(nèi),NRF3的基因表達(dá)水平上調(diào),而KEAP1的表達(dá)水平下調(diào),說明NRF1和KEAP1很可能存在相互作用。在NRF2選擇性沉默的細(xì)胞內(nèi),NRF1的蛋白水平和NRF3的基因表達(dá)均上調(diào),KEAP1的表達(dá)下調(diào),說明NR

10、F1和NRF3在砷暴露下可以彌補(bǔ)NRF2沉默導(dǎo)致的功能障礙,而且NRF2和KEAP1存在結(jié)合和相互調(diào)控。KEAP1基因的沉默導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NRF2蛋白表達(dá)水平的上調(diào),尤其是細(xì)胞核內(nèi)的聚集,但該分子的沉默卻導(dǎo)致了NRF1蛋白表達(dá)的下調(diào),說明NRF1和NRF2存在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ARE位點(diǎn)的作用機(jī)制,而且進(jìn)一步確定了NRF1和KEAP1之間可能存在相互結(jié)合。NRF3基因的沉默不影響細(xì)胞內(nèi)NRF1、NRF2和KEAP1的表達(dá)水平。說明NRF3可能是一種

11、相對(duì)獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄因子。另外,我們使用了多種化合物和重金屬毒物,發(fā)現(xiàn)只有砷可以激活NRF1。
　　 結(jié)論：
　　 1.砷可以激活NRF1和NRF2,其蛋白表達(dá)并且存在時(shí)間和劑量依賴性;2.NRF1和NRF2在砷誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性中發(fā)揮保護(hù)性作用;3.NRF1可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)GCLC、GCLM、SRX和NQO1的表達(dá)水平,NRF2不僅調(diào)控上述基因,對(duì)HMOX-1的調(diào)控作用也很明顯。NRF2在調(diào)控ARE相關(guān)基因的作用比NRF1強(qiáng);4.

12、KEAP1的沉默在正常生理狀態(tài)下即可導(dǎo)致NRF2的蛋白聚集及NRF2調(diào)控的ARE目的基因的表達(dá),增強(qiáng)包括GCLC、GCLM、SRX、NQO1的表達(dá),但在砷誘導(dǎo)的情況下,KEAP1的沉默并不能進(jìn)一步增高砷導(dǎo)致的ARE目的基因的增高;5.NRFs和KEAP1之間的相互作用:(1)NRF1和NRF3可以彌補(bǔ)NRF2的沉默,而NRF2不能彌補(bǔ)NRF1的沉默;(2)NRF1和NRF2的沉默導(dǎo)致KEAP1的表達(dá)下降。(3)KEAP1的沉默導(dǎo)致NRF