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文檔簡介
1、植物在逆境脅迫下常常會因吸收不到足夠的營養(yǎng)物質而不能維持正常的生理功能。低溫、干旱、ABA、高鹽等非生物脅迫是廣泛影響作物生產和植物生長的不利生境。當植物處于某一脅迫環(huán)境中時,植物會調控自身含有的與脅迫相關的基因的表達,產生相應的適應性。目前已經克隆了許多脅迫相關基因,用于植物抗逆基因工程中,并得到了一些有一定抗逆性的轉基因植株,展示了廣闊的前景。 程序性細胞死亡是指為維持內環(huán)境的穩(wěn)定,由基因控制的細胞自主且有序性的死亡,它涉及
2、一系列基因的激活、表達以及調控等,在真核生物發(fā)育、免疫調控和細胞穩(wěn)態(tài)平衡方面發(fā)揮了重要作用,因而是具有生理性和選擇性的。通常情況下,細胞死亡被分為細胞壞死和凋亡(PCD)。前者是因病理而產生的被動死亡,如由化學性或物理性的損害因子、缺氧或營養(yǎng)不良等條件引起的細胞壞死。后者是一種程序化的主動性細胞死亡,是通過依賴于caspases的蛋白家族定義的。但是大量研究結果表明還存在caspase非依賴性的細胞程序性死亡,已被人們初步認識的有自體吞
3、噬作用等途徑。 自體吞噬是廣泛存在于真核細胞中的一種溶酶體依賴性的降解途徑,它能引起細胞中長壽命蛋白的降解,參與細胞的正常生長發(fā)育過程和維持代謝平衡。在某些壓力條件下,如在損傷、營養(yǎng)匱乏、饑餓狀態(tài)等情況下,可以循環(huán)利用細胞組分最終使細胞得以生存,甚至在某些組織的癌變過程中也扮演重要角色。自體吞噬作為廣泛存在于真核細胞中的生命現(xiàn)象,貫穿于正常細胞生長發(fā)育和生理病理過程,對防止如神經退行性病變、腫瘤、心肌病、病原微生物侵入感染等疾病
4、以及對防止老化、延長壽命有積極作用。因此對細胞自噬作用和自噬型細胞死亡的研究不僅具有理論意義,而且也具有非常重要的應用價值。自噬基因的發(fā)現(xiàn)使我們從分子水平認識了自噬,但對自噬起源、信號轉導及其對細胞生存影響的了解尚不全面。隨著對自噬作用機制的深入研究,我們期望可以通過調控細胞的自噬水平,控制癌癥及神經退行性疾病的發(fā)展,延緩衰老,提高生存質量。 近年來由于分子生物學、基因組學等實驗手段的日臻完善,尤其是酵母自噬突變株的產生,使得對
5、自噬分子基礎的研究有了很大的進展。ATG8編碼的蛋白是自噬降解途徑中的核心蛋白。通過化學合成或剔除ATG8能抑制自體吞噬,從而阻止ROS積累和細胞死亡。這揭示了自體吞噬在細胞死亡中有很重要的作用機制。 本實驗采用RT—PCR方法,擴增得到ATG8e、ATG8f ATG8h,利用植物表達載體pCAMBIA3301(分別攜帶CamV35S,rd29A,SEN1啟動子)和農桿菌GV3101將其在擬南芥中過量表達。用除草劑篩選獲得抗性苗
6、,并進一步得到純合系,然后對其進行了分子生物學的驗證并在脅迫條件下觀察表型。 轉基因植株的分子生物學檢測如下: 1.轉基因植株均能通過PCR擴增出約500bp的Bar基因的特異性條帶,表明所構建的載體已經整合到擬南芥基因組中。 2.在所篩選到的rd29A—8f的純合株系中,隨機挑選三株(3—3—6,4—3—5,6—6—3)與野生型對照同時進行不同的脅迫處理(ABA、低溫、高鹽等),24h后取材,提取植株的RNA并
7、進行RT—PCR。結果顯示:從整體上看,處理后的轉基因純合系ATG8f的表達量與處理前相比有不同程度上升,而野生型處理前后ATG8f含量差別不大。說明了在這些脅迫條件下,rd29A啟動子啟動ATG基因的表達。 同時,將純合系與野生型植株同時置于不同的脅迫條件下,如:干旱、低溫、ABA、NaCl,觀察各種植株在不同處理條件下的表型。結果發(fā)現(xiàn):(1)干旱、低溫等脅迫條件下,自體吞噬發(fā)揮抗細胞死亡的作用,純合系比野生型生長良好;(2)
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