東方粘蟲微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建與遺傳標(biāo)記篩選.pdf

1、東方粘蟲Pseudaletia separata(Walker)是我國和其它亞洲國家糧食作物的主要害蟲之一，廣泛分布于我國各地。東方粘蟲具有遷飛性、暴食性等特點(diǎn)，容易暴發(fā)成災(zāi).我國科學(xué)家曾對其宏觀遷飛規(guī)律、遷飛行為機(jī)制、飛行與生殖的關(guān)系等進(jìn)行了深入研究，但對其種群分子遺傳學(xué)卻很少涉及。本研究著力于東方粘蟲微衛(wèi)星標(biāo)記的分離和鑒定，為以后種群遺傳學(xué)研究準(zhǔn)備工具；同時(shí)，本研究對該物種基因組微衛(wèi)星特征和變異進(jìn)行了較深入地分析，并優(yōu)化了鱗翅目成蟲

2、DNA提取的技術(shù)方法.
　　 將傳統(tǒng)的蛋白酶K+SDS+苯酚抽提方法和CTAB方法結(jié)合起來，篩選出從東方粘蟲成蟲自然種群的乙醇保存標(biāo)本中提取高質(zhì)量、高產(chǎn)量基因組DNA的方法，用于制備分離微衛(wèi)星標(biāo)記所需的DNA樣品。對比研究結(jié)果表明，用CTAB+傳統(tǒng)方法提取DNA時(shí)，取腹部中段10～20 mg組織樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同種群DNA產(chǎn)品合格率68.42％～95.28％,提取合格DNA量5.59～10.04 mg/g，顯著高于傳統(tǒng)蛋白酶K+

3、SDS裂解及苯酚抽提方法的7.69％～40％和2.83～5.78 mg/g。另外，用熱NaOH法快速制備用于大規(guī)?；蚍中偷腄NA樣品的研究結(jié)果表明，對于胸部和腹部組織樣品，用熱NaOH溶液處理20 min，就能夠提取出微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增反應(yīng)所需的DNA樣品；對于頭部組織樣品，用熱NaOH溶液處理40～60 min是比較合適的。對比研究結(jié)果顯示，來自熱NaOH方法的DNA樣品在構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫過程中失敗，但兩種樣品作為模板進(jìn)行微衛(wèi)星PC

4、R擴(kuò)增的產(chǎn)物在遺傳分析儀上檢測結(jié)果相同。
　　 利用生物素5’標(biāo)記的(CA)15、(GA)15、(ATG)12、(GAT)12、(TAGA)8和(GTGA)8作為探針，采用磁珠富集法構(gòu)建東方粘蟲微衛(wèi)星富集文庫。經(jīng)過基因組DNA酶切、300-700bp片段回收、連接接頭、純化、連接產(chǎn)物變性、已結(jié)合探針的磁珠捕捉目標(biāo)片段、目標(biāo)片段洗脫、PCR擴(kuò)增、連接pGEM-T載體并轉(zhuǎn)化DH5α高效感受態(tài)細(xì)胞、藍(lán)白篩選等過程，最后構(gòu)建成功包含85

5、31個(gè)克隆的粘蟲微衛(wèi)星富集文庫.從文庫隨機(jī)抽取866個(gè)克隆進(jìn)行測序，并分析序列中是否含有微衛(wèi)星，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，所建文庫中平均微衛(wèi)星陽性克隆率35.8％，高于以往對棉鈴蟲、馬尾松毛蟲等鱗翅目昆蟲進(jìn)行同類研究的結(jié)果。
　　 用REPEATMASKER軟件和人工分析相結(jié)合，對本研究已篩選出的一批東方粘蟲微衛(wèi)星的類型、各類豐度、變異情況等進(jìn)行深入分析，并與InSatDb數(shù)據(jù)庫中5種全基因組測序昆蟲（黑腹果蠅、岡比亞按蚊、赤擬谷盜、意大利

6、蜜蜂、家蠶）基因組中微衛(wèi)星的特征和變異情況進(jìn)行比較.本研究已發(fā)現(xiàn)369個(gè)東方粘蟲微衛(wèi)星序列、46個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域、6個(gè)轉(zhuǎn)座元件和1個(gè)tRNA.所得微衛(wèi)星分屬于21個(gè)不同重復(fù)基序，以TTG/CAA基序的微衛(wèi)星最多，占全部微衛(wèi)星總數(shù)的37.13％，其次是CA/TG類和CAT/ATG類，分別占30.89％和15.72％。這三類微衛(wèi)星合起來占全部微衛(wèi)星的83.74％。所得微衛(wèi)星序列還具有短型偏多、不完全型（存在突變）偏多、AT富集的偏多、復(fù)合型較

7、少等特點(diǎn).這些特點(diǎn)與5種全基因組測序昆蟲微衛(wèi)星的統(tǒng)計(jì)結(jié)果基本一致。對不完全型微衛(wèi)星的重復(fù)序列變異情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，替換堿基比例一般0.6％-11.7％，個(gè)別達(dá)到15.6％-26.1％;缺失堿基比例0.5％-10.6％，插入堿基比例0.3％-11.3％，平均每處插入/缺失堿基1-1.8，個(gè)別達(dá)到3-6個(gè)堿基。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，東方粘蟲微衛(wèi)星重復(fù)序列的變異還存在如下特點(diǎn)：堿基替換在突變中占據(jù)優(yōu)勢，在全部微衛(wèi)星基因座中發(fā)生比例達(dá)到92.38％，而

8、缺失和插入微衛(wèi)星比例分別只有27.62％和25.24％;替換+插入、替換+缺失的發(fā)生比例接近，均為20％稍多，而缺失+插入、替換+缺失+插入的比例較低，均為12％稍多；兩類數(shù)量最多的微衛(wèi)星TTG/CAA(137個(gè))、TG/CA(114個(gè))的重復(fù)序列變異中，轉(zhuǎn)換和顛換發(fā)生的頻率并不相同，轉(zhuǎn)換要多于顛換；重復(fù)序列長度101-150bp和151-200bp的微衛(wèi)星發(fā)生變異的概率較大，變異堿基數(shù)較多，而小于50bp和大于200bp的微衛(wèi)星變異比

9、例和堿基變異比例均明顯減?。籘TG/CAA類的變異微衛(wèi)星比例高于TG/CA類，而變異堿基比例則明顯低于后者；變異微衛(wèi)星重復(fù)序列近5’端（將一個(gè)重復(fù)序列分為五段，即5’端、近5’端、中段、近3’端、3’端）變異堿基數(shù)最多，其次是中段，而兩極則相對較少發(fā)生變異，而且變異最多區(qū)域出現(xiàn)在近5’端的微衛(wèi)星數(shù)量也最多。另外，在各類微衛(wèi)星基因座側(cè)翼序列比較中，僅發(fā)現(xiàn)11類側(cè)翼序列相同的多拷貝微衛(wèi)星基因座，涉及微衛(wèi)星基因座24個(gè)，占所發(fā)現(xiàn)全部微衛(wèi)星基因

10、座的6.50％.但并沒有發(fā)現(xiàn)側(cè)翼序列高度相似的微衛(wèi)星家族。
　　 在含有微衛(wèi)星的克隆序列中，經(jīng)過序列選擇、引物設(shè)計(jì)和合成、Touchdown PCR初選（24個(gè)基因組DNA樣品）、優(yōu)化PCR優(yōu)選（24個(gè)基因組DNA樣品）、遺傳分析儀再選（48個(gè)基因組DNA樣品）等三輪篩選，共篩出8個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記（GenBank登錄號FJ896055-FJ896062）。對8個(gè)微衛(wèi)星基因座在48個(gè)樣品中的等位基因分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并用Gene

11、Pop軟件進(jìn)行檢測，經(jīng)Bonferroni校正，均符合哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg proportions），微衛(wèi)星基因座之間也沒有檢測出顯著的配子相不平衡（gametic phase disequilibrium）。用Cervus軟件統(tǒng)計(jì)計(jì)算，各基因座有11-31個(gè)等位基因，期望雜合度0.747-0.931，顯示出各基因座都具較好多態(tài)性，可用做東方粘蟲種群研究的遺傳標(biāo)記.
　　 本研究的創(chuàng)新之處主要表現(xiàn)在以下