赤魟（Dasyatis akajei）白細胞介素8（Interleukin-8）的功能研究與進化分析.pdf

1、以我國南海海洋生物軟骨魚赤魟作為研究對象，綜合應(yīng)用基因工程、蛋白純化等分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)和生物信息等功能基因組研究方法和技術(shù)手段進行研究。在實驗室已克隆的赤魟白細胞介素8(IL-8)基因序列的基礎(chǔ)上，對趨化因子家族重要成員的IL-8進行進化與功能的分析和研究，并且制備了多克隆抗體，為利用免疫學(xué)方法進一步研究提供了必需的輔助材料。以期開發(fā)軟骨魚赤魟的分子生物學(xué)資源，并在闡明IL-8基因在魚類中的生理活性機制基礎(chǔ)上，為其潛在應(yīng)用價值提供

2、直接的實驗證據(jù)支持。 氨基酸序列分析表明，赤魟IL-8具有保守的四個半胱氨酸(Cys)，且N端為CXC，屬于CXC型趨化因子。和其它已報導(dǎo)的魚類IL-8一樣，赤缸IL-8缺乏經(jīng)典的ELR motif，并且與人、鼠等哺乳類的IL-8氨基酸序列同源性較低。不同于哺乳動物中IL-8序列的高度保守，已報道的魚類中的IL-8序列相似性也較低，這可能跟魚類中IL-8 正在高速進化有關(guān)。 選取赤魟IL-8的成熟肽構(gòu)建了硫氧還蛋白(TR

3、X)融合表達載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中進行了原核表達。以0.2mM IPTG做誘導(dǎo)劑25℃過夜誘導(dǎo)表達12小時，成功獲得了可溶的重組融合蛋白rTRX-IL8。采用Ni<'2+>螯和親和層析和G25分子篩等純化步驟獲得到了較高純度的重組IL-8成熟蛋白。HPLC分析純化后的重組IL-8蛋白純度在80～90﹪之間。 制備了多克隆抗體，Western blotting結(jié)果顯示純化后的抗體特異性良好，Dotblotting檢測

4、抗體效價達到了1:50，000。為利用免疫學(xué)方法進一步研究IL-8基因，及其表達產(chǎn)物的性質(zhì)、功能以及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及抑制腫瘤遷移的可能作用機制等提供了必需的輔助材料。對赤魟重組IL-8的生物學(xué)活性進行了研究。赤魟重組IL-8對豚鼠中性粒細胞的體外趨化實驗結(jié)果顯示其確實具有中性粒細胞趨化功能，并且這種趨化作用呈濃度依賴性。赤魟的IL-8雖然缺乏ELR motif，依然具有趨化中性粒細胞的功能，讓我們聯(lián)想到魚類中IL-8趨化功能的行使可能與E