莪術(shù)醇抗乳腺癌轉(zhuǎn)移作用及潛在靶標(biāo)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、背景：乳腺癌是當(dāng)今世界女性最多發(fā)的惡性腫瘤之一。2016年《Cancer Statistics》數(shù)據(jù)顯示，2015年美國(guó)女性癌癥發(fā)病率中乳腺癌以29％的比率獨(dú)占鰲頭，死亡率僅次于肺癌，居第二位。在中國(guó)，2009-2011年間女性癌癥發(fā)病率顯著增加。其中，乳腺癌位居第一位，且呈逐年增加態(tài)勢(shì)。
　　中藥莪術(shù)在傳統(tǒng)上用于治療宮頸癌、乳腺癌等婦科腫瘤，莪術(shù)油被認(rèn)為是主要的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，其中莪術(shù)醇是代表性化合物之一。目前，莪術(shù)醇抑制腫瘤轉(zhuǎn)移

2、的報(bào)道還很少，其潛在分子機(jī)制還需要深入研究。
　　本課題獲得了中央高?；A(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目基金(XDJK2014B044)的支持。目的：
　　進(jìn)一步明確莪術(shù)醇在抑制乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲與粘附方面的作用，深入地闡明其可能的新型分子機(jī)制和分析潛在的靶標(biāo)蛋白。
　　方法：利用磺酰羅丹明B（SRB）法檢測(cè)細(xì)胞存活率，平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。采用Ibidi劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)乳腺癌細(xì)胞體外的遷移能力。通過T

3、ranswell侵襲實(shí)驗(yàn)明確莪術(shù)醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。利用Matrigel粘附實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)乳腺癌細(xì)胞粘附基底膜的能力。免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)，明膠酶譜法檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。采用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)莪術(shù)醇對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　采用二維凝膠電泳技術(shù)分離莪術(shù)醇與溶劑對(duì)照處理后的MDA-MB-231細(xì)胞蛋白，分析差異表達(dá)蛋白，切取差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，并通過MALDI-TOF/TO

4、F進(jìn)行鑒定。利用Gene Ontology（GO）分析法明確差異蛋白的功能類別，利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析所涉及的相關(guān)通路，分析出可能與莪術(shù)醇抗乳腺癌轉(zhuǎn)移作用相關(guān)的靶標(biāo)，再利用Protein-Protein Interaction prediction（PPI）法找出與潛在靶標(biāo)相互作用的蛋白質(zhì)。最后，采用RT-PCR方確認(rèn)在mRNA水平莪術(shù)醇對(duì)潛在蛋白靶標(biāo)表達(dá)的影響

5、。
　　結(jié)果：
　　1.莪術(shù)醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和粘附的影響
　　SRB法檢測(cè)莪術(shù)醇細(xì)胞毒性顯示，當(dāng)莪術(shù)醇濃度小于40μg/ml作用24 h后對(duì)MDA-MB-231和4T1細(xì)胞無細(xì)胞毒性。連續(xù)處理14天后，40μg/ml莪術(shù)醇可顯著抑制克隆的形成。為排除細(xì)胞毒性的影響，本研究選用10、20、40μg/ml濃度的莪術(shù)醇進(jìn)一步明確其體外抗乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和粘附能力。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和Ibdi劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

6、明，莪術(shù)醇處理MDA-MB-231細(xì)胞8h后，其體外遷移能力顯著降低。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，莪術(shù)醇能夠顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力。粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，莪術(shù)醇能明顯降低MDA-MB-231細(xì)胞粘附能力。
　　2.莪術(shù)醇抗乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移可能與JNK/Akt/NF-κB介導(dǎo)的MMP-9信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)
　　明膠酶譜結(jié)果顯示，莪術(shù)醇作用MDA-MB-231細(xì)胞24h后，MMP-9酶活性降低。Western

7、 Blot分析顯示，莪術(shù)醇處理MDA-MB-231細(xì)胞后，MMP-9蛋白表達(dá)降低，JNK1/2、Akt磷酸化水平降低。同時(shí)，莪術(shù)醇亦抑制了NF-κB p65蛋白的核轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)錄活性。并且，JNK1/2抑制劑SP600125和PI3K-Akt抑制劑LY294002能夠分別增強(qiáng)莪術(shù)醇對(duì)NF-κB p65蛋白核轉(zhuǎn)移的抑制作用。同時(shí)，JNK1/2抑制劑SP600125、PI3K-Akt抑制劑LY294002和NF-κB抑制劑PDTC均能分別顯著增

8、強(qiáng)莪術(shù)醇對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)的抑制作用以及莪術(shù)醇對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲和粘附的抑制作用。
　　3.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定莪術(shù)醇抗乳腺癌轉(zhuǎn)移作用的潛在靶標(biāo)
　　采用二維凝膠電泳技術(shù)分離莪術(shù)醇與溶劑對(duì)照作用的MDA-MB-231細(xì)胞蛋白，共發(fā)現(xiàn)了19個(gè)差異蛋白，采用MALDI-TOF/TOF生物質(zhì)譜成功鑒定了其中11個(gè)蛋白。GO分析顯示，此11種蛋白分布在不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，參與了多種重要的生物過

9、程，表現(xiàn)出不同的分子功能。KEGG分析可知，鑒定的11種蛋白參與到76條信號(hào)通路中。特別地，結(jié)合GO分析結(jié)果，KEGG分析結(jié)果和查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)蛋白（EEF1A1、NRAS、SUB1、ACAT2）可能與莪術(shù)醇抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲和粘附有關(guān)。我們利用PPI分析得到與這4種蛋白相互作用的蛋白。最后，應(yīng)用RT-PCR對(duì)這4個(gè)靶標(biāo)在mRNA水平進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)了莪術(shù)醇能夠在轉(zhuǎn)錄水平上劑量依賴性地調(diào)控這4個(gè)蛋白的mRNA水平，