GFP-HCMVIE1融合蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞分泌功能與凋亡的影響.pdf

1、目的:構(gòu)建人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE1蛋白與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP融合蛋白真核細(xì)胞表達(dá)載體pEGFP-C1/IE1,將其轉(zhuǎn)染入THP-1巨噬細(xì)胞,初步探討GFP-HCMV IE1融合蛋白瞬時(shí)高表達(dá)對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子活性及其凋亡的影響,為進(jìn)一步研究IE1蛋白在HCMV致病機(jī)制中的作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　(1)用 HindⅢ和BamHⅠ雙酶切 pNEB193/IE1質(zhì)粒,將 IE1基因片段亞克隆入

2、pcDNA3.1(+)載體,雙酶切鑒定及測(cè)序分析;SalⅠ和BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/IE1,然后將目的基因亞克隆入 pEGFP-C1,構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-C1/IE1。
　　(2)將真核表達(dá)載體pEGFP-C1/IE1與pEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分3組:巨噬細(xì)胞空白對(duì)照組(Control組);pEGFP-C1轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞組(GFP組);pEGFP-C1/IE1轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞組(GFP

3、-IE1組)。轉(zhuǎn)染48h后,通過Western-blotting和倒置熒光顯微鏡檢測(cè)GFP-HCMVIE1融合蛋白或GFP的表達(dá)與定位。
　　(3)利用ELISA分別檢測(cè)12h、24h、48h各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β的含量;采用RT-PCR檢測(cè)其mRNA的表達(dá);收集巨噬細(xì)胞經(jīng)PI染色后流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)其凋亡率。
　　(4)利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果:
　　(1)

4、IE1基因亞克隆至pcDNA3.1(+)載體上后,經(jīng)雙酶切及測(cè)序分析,所克隆的目的片段與 GenBank上公布的HCMV IE1基因序列完全一致,然后將目的片段亞克隆入pEGFP-C1中,雙酶切結(jié)果顯示構(gòu)建了真核表達(dá)載體pEGFP-C1/IE1,且GFP-IE1融合蛋白在THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)并定位于細(xì)胞核,GFP在整個(gè)細(xì)胞中均勻表達(dá)。Western-blotting結(jié)果表明在 THP-1巨噬細(xì)胞中表達(dá)了分子量約101.4kD的融

5、合蛋白。
　　(2)轉(zhuǎn)染12h時(shí),GFP-IE1組培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β含量明顯升高,隨著時(shí)間的遞增,2種細(xì)胞因子分泌量呈上升趨勢(shì),與空白對(duì)照組或 GFP組比較差異有顯著性(P<0.01)。GFP瞬時(shí)表達(dá)對(duì)2種細(xì)胞因子的分泌影響差異無顯著性(P>0.05)。GFP-IE1組TNF-α和IL-1βmRNA表達(dá)水平均增加。
　　(3)轉(zhuǎn)染后48h,GFP-IE1組巨噬細(xì)胞凋亡率明顯升高,與空白對(duì)照組或GFP組比較差異有

6、顯著性(P<0.01),而GFP組巨噬細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較差異無顯著性(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體 pEGFP-C1/IE1,且能在 THP-1巨噬細(xì)胞中表達(dá)GFP-HCMV IE1融合蛋白并定位于細(xì)胞核。
　　(2) GFP-HCMV IE1融合蛋白瞬時(shí)高表達(dá)上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-1β。
　　(3) GFP-HCMV IE1融合蛋白瞬時(shí)高表達(dá)誘導(dǎo)THP