中藥多成分藥代動力學(xué)的新方法和策略研究.pdf

1、中藥多成分藥代動力學(xué)（簡稱多成分藥代）是中醫(yī)藥理論和作用機(jī)制闡明的重要研究內(nèi)容。但是由于中藥成分的復(fù)雜和多樣性，以及中藥成分與生物體系相互作用的復(fù)雜性和不確定性，中藥多成分藥代動力學(xué)的研究一直面臨著巨大挑戰(zhàn):(1)中藥化學(xué)成分復(fù)雜、體內(nèi)代謝多樣化，使得體內(nèi)成分的結(jié)構(gòu)鑒定困難;(2)藥代動力學(xué)研究的目標(biāo)化合物不明確、在中藥及生物樣本濃度低、內(nèi)源性基質(zhì)和組分之間干擾大、對照品缺乏，導(dǎo)致中藥多成分檢測和定量方法的建立困難;(3)藥效指標(biāo)不統(tǒng)一

2、、有效成分不明確，導(dǎo)致中藥藥代動力學(xué)研究結(jié)果的綜合評價和應(yīng)用不充分。因此需要運(yùn)用先進(jìn)的分析技術(shù)，能夠快速、準(zhǔn)確、全面的定性分析中藥體內(nèi)多成分，靈敏、快速、準(zhǔn)確、寬動態(tài)范圍的定量分析中藥體內(nèi)多成分，建立符合中醫(yī)治病整體觀的更深層次和更廣視角的新策略，為符合中醫(yī)理論的中藥多成分藥代動力學(xué)研究提供技術(shù)支持和科學(xué)數(shù)據(jù)。
　　本論文針對中藥藥代動力學(xué)研究存在的一些瓶頸問題，分別選擇了巫山淫羊藿、小續(xù)命湯有效成分組和二仙湯為研究對象，探索性地

3、開展了中藥多成分藥代動力學(xué)研究所需分析新技術(shù)和新策略的研究工作。
　　論文第一部分針對中藥多成分藥代研究缺乏體內(nèi)成分及其代謝物對照品的瓶頸問題，探索性地基于體內(nèi)主要成分代謝途徑的全面詮釋，建立多成分藥代指標(biāo)成分的研究策略。該策略首先采用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用方法(HPLC-HRMSn)和質(zhì)譜樹狀圖相似度過濾(MTSF)技術(shù)對淫羊藿5個主要異戊烯基黃酮成分在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析和鑒定，基于體內(nèi)代謝物的鑒定結(jié)果推斷

4、5種主要異戊烯基黃酮的代謝途徑，將血漿中主要暴露的14個原型成分和葡萄糖醛酸代謝物選為潛在的藥代指標(biāo)成分，作為測定對象，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)（HPLC-MS/MS），初步研究了5種主要異戊烯基黃酮灌胃給予大鼠后，這14個體內(nèi)成分在血漿中的主要藥動學(xué)參數(shù)特征;由于葡萄糖醛酸結(jié)合型代謝物沒有對照品，因此采用酶水解的方法將血漿樣本中的這14個體內(nèi)成分轉(zhuǎn)化為有對照品、且存在代謝轉(zhuǎn)化關(guān)系的10個潛在藥代指標(biāo)成分作為藥代動力學(xué)的研究對象

5、，建立了HPLC-MS/MS分析方法:在色譜分離方面，通過優(yōu)化兩種流動相的比例和混合時間，在二元液相泵上實現(xiàn)了四元流動相的分離效果，消除了朝藿定A-C/淫羊藿苷的cross-talk和淫羊藿素的基質(zhì)效應(yīng);在質(zhì)譜檢測方面，采用分段多反應(yīng)監(jiān)測模式，縮短了質(zhì)譜的duty cycle，從而增加了方法的靈敏度。所建立的方法經(jīng)過了方法驗證，能夠滿足生物樣品分析，并被應(yīng)用于研究5種主要異戊烯基黃酮和巫山淫羊藿灌胃給予大鼠后，10個潛在的藥代指標(biāo)成分在

6、血漿中的主要藥動學(xué)參數(shù)特征;采用Kendall's tau-b等級相關(guān)分析法對酶水解前后血漿中測得的指標(biāo)成分的濃度隨給藥時間的變化進(jìn)行相關(guān)性分析。實驗結(jié)果表明淫羊藿素的葡萄糖醛酸結(jié)合型代謝物是巫山淫羊藿灌胃給藥后，異戊烯基黃酮在大鼠體內(nèi)的主要存在形式。另外，酶水解血漿中的總淫羊藿素水平能夠同時反映異戊烯基黃酮在體內(nèi)的暴露量和動態(tài)變化。因此，具有高暴露量和較好相關(guān)性(r＞0.5)的淫羊藿素可以作為巫山淫羊藿異戊烯基黃酮的藥代指標(biāo)成分。除此

7、之外，還利用淫羊藿素的藥代特征建立數(shù)學(xué)模型，用于預(yù)測大鼠體內(nèi)巫山淫羊藿的暴露量。結(jié)果顯示預(yù)測值與實驗值有較好的一致性，進(jìn)一步證實酶水解血漿中的淫羊藿素可以作為巫山淫羊藿中異戊烯基黃酮的藥代指標(biāo)成分。
　　論文第二部分研究了中藥復(fù)方小續(xù)命湯抗腦缺血的有效成分組(AF-XXMD)的多成分藥代。采用HPLC-HRMSn方法和MTSF技術(shù)分析和鑒定AF-XXMD中68種化學(xué)成分，對大鼠血漿和腦內(nèi)高暴露水平的化學(xué)成分，采用反向分子對接的方法

8、，預(yù)測了藥理活性，選擇大鼠血漿和腦組織21個高暴露且預(yù)測有活性的化合物作為藥代指標(biāo)成分，建立高分離度快速液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(RRLC-MS/MS)。前處理方法通過添加抗壞血酸保護(hù)血漿中的黃芩苷和黃芩素不被氧化，通過脂質(zhì)預(yù)處理柱除去磷脂，以消除血漿和腦組織中甘草酸的基質(zhì)效應(yīng);色譜分離采用RRLC法，可實現(xiàn)3對同分異構(gòu)體的基線分離;質(zhì)譜檢測采用分時間段的正負(fù)離子切換模式，并通過添加微量的甲酸銨(0.08mmol l-1)提高各化合物的質(zhì)譜響

9、應(yīng)。對所建方法進(jìn)行了方法驗證，表明該方法符合生物樣品分析方法的技術(shù)要求，滿足大鼠腦組織和血漿中的藥代動力學(xué)研究需要;采用正常大鼠與雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎導(dǎo)致的慢性腦缺血模型大鼠，灌胃給予AF-XXMD，比較研究了21個指標(biāo)成分的血漿和靶器官腦的藥動學(xué)特征和差異。研究結(jié)果顯示在慢性腦缺血病理模型下AF-XXMD的藥代特征發(fā)生明顯的改變，包括血腦透過率、腦部動態(tài)變化、腦部暴露量和腦組織不同部位分布。慢性腦缺血大鼠灌胃給予AF-XXMD后最主要的化

10、合物是黃酮和色原酮類化合物，而腦部最主要的化合物為色原酮和生物堿類化合物。AF-XXMD對慢性腦缺血的治療效果與色原酮、黃酮和生物堿類化合物作用于多個靶點和多條代謝通路有關(guān)。
　　論文第三部分以中藥復(fù)方二仙湯為研究對象，整合中藥復(fù)方中化合物的識別與鑒定、代謝組學(xué)、生物信息學(xué)的技術(shù)與方法，從中醫(yī)藥治病整體觀角度，探索中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，包括來源于中藥的外源性成分、被中藥擾動的機(jī)體內(nèi)源性成分，以及這些成分與藥效的關(guān)系和其作用機(jī)制的研

11、究思路和策略。
　　首先，建立了快速識別與鑒定中藥復(fù)方中未知化合物的新策略。這個新策略能夠快速識別候選化合物的結(jié)構(gòu)信息，并為結(jié)構(gòu)鑒定提供有效的線索。這個策略主要包括以下四步:1、建立了HPLC-HRMSn的中藥成分的分析方法，獲得高分辨質(zhì)量數(shù)和多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，利用MTSF技術(shù)，識別潛在化合物并獲得其母核信息;2、基于保留時間和高分辨質(zhì)量數(shù)，利用判別分析方法，對潛在化合物按類別進(jìn)行分類;3、將MTSF技術(shù)和判別分析方法獲得的潛在化合物

12、的結(jié)構(gòu)母核信息進(jìn)行匹配，母核信息一致的潛在化合物作為候選化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定;4、基于同位素分布數(shù)據(jù)對鑒定的候選化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證。這個新策略能夠在MTSF技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步排除約41％的不相關(guān)離子信息，同時還能夠提供553個候選化合物的準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)類型信息，最終鑒定出71個化合物。以鑒定的71個化合物為模板，基于MTSF技術(shù)，從二仙湯灌胃給藥后的大鼠血漿、尿、糞、膽汁中鑒定出13個原型成分和150個代謝物。
　　其次，建立了高通量不同

13、官能團(tuán)類型甾體激素的UHPLC-MS/MS定量分析方法，實現(xiàn)了一份生物樣本一次分析中，同時進(jìn)行羰基和酚羥基甾體激素的衍生化分析。所建立的方法僅需要500μL血清樣本，可在單次運(yùn)行時間28min內(nèi)定量分析20個甾體激素類化合物。該方法首先采用液液萃取技術(shù)從生物樣本中提取甾體激素，緊接著進(jìn)行離線的吉拉德P衍生化，然后采用自動化的進(jìn)樣程序自動吸取兩次樣本:第一次將吉拉德P衍生化的羰基類甾體激素加載到色譜柱上;第二次使甾體激素在進(jìn)樣針中進(jìn)行丹磺

14、酰氯的在線衍生化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后再將丹磺酰氯衍生化的酚羥基類甾體激素加載到色譜柱上。與此同時，質(zhì)譜切換閥與進(jìn)樣程序密切配合，以導(dǎo)入衍生化的甾體激素和去除多余的衍生化試劑，而后質(zhì)譜對導(dǎo)入的兩種類型的甾體激素衍生化產(chǎn)物按順序分別進(jìn)行分析。方法驗證結(jié)果表明:線性范圍為2～400pg/mL，相關(guān)系數(shù)r值均高于0.988，最低定量限范圍為2～4pg/mL，各化合物精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值不大于20％，準(zhǔn)確度在80～120％之間，完全能夠滿

15、足生物樣本中甾體激素的分析要求。
　　再次，基于脂質(zhì)組學(xué)開展了二仙湯對不同絕經(jīng)階段雙側(cè)去卵巢大鼠的調(diào)節(jié)作用研究，設(shè)置了假手術(shù)組、雙側(cè)去卵巢模型組、模型給予二仙湯組和模型給予尼爾雌醇組。將體重、血脂指標(biāo)（膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和甘油三酯）和肝臟油紅O染色切片檢查作為藥效學(xué)指標(biāo)，評價二仙湯給藥后不同時間點的藥效學(xué)。在藥效學(xué)研究的同時，基于建立的激素、脂質(zhì)和鞘脂組學(xué)分析平臺，結(jié)合統(tǒng)計學(xué)方法，開展脂質(zhì)代謝組學(xué)研究;研究去卵巢大

16、鼠血漿和肝組織紊亂的脂質(zhì)代謝特征，以及二仙湯干預(yù)后不同絕經(jīng)階段去卵巢大鼠血漿和肝組織紊亂的脂質(zhì)代謝特征，基于脂質(zhì)合成與代謝通路，系統(tǒng)詮釋了二仙湯調(diào)節(jié)脂代謝紊亂的作用機(jī)制，并研究不同絕經(jīng)階段病理變化和二仙湯治療的特點。結(jié)果表明，二仙湯能有效調(diào)節(jié)雙側(cè)去卵巢引起的甾體激素和脂質(zhì)的合成與代謝紊亂，其中以給藥后4周發(fā)現(xiàn)的能夠同時指征雙側(cè)去卵巢模型脂代謝紊亂和二仙湯調(diào)節(jié)作用的潛在生物標(biāo)志物的數(shù)量最多，包括血漿中15種甘油酯、10種磷脂酰甘油酯和4種

17、甾體激素，肝臟中8種甘油酯和10種磷脂酰甘油酯。除此之外，基于不同絕經(jīng)階段發(fā)現(xiàn)的潛在生物標(biāo)志物的數(shù)量、種類、重復(fù)出現(xiàn)的生物標(biāo)志物等研究，發(fā)現(xiàn)二仙湯的調(diào)節(jié)作用與時間密切相關(guān)。
　　最后，基于反向分子對接的方法，對二仙湯進(jìn)入體內(nèi)的主要成分進(jìn)行反向分子對接，篩選出導(dǎo)致代謝通路變化的潛在藥效物質(zhì)，構(gòu)建與藥效相關(guān)的內(nèi)源性代謝物和外源性中藥成分之間的關(guān)系（物質(zhì)基礎(chǔ)），并采用Western-blot和ELISA方法，驗證了二仙湯參與調(diào)節(jié)血漿和肝