國產石杉科藥用植物的分子生物學研究.pdf

1、石杉科(Huperziaceae)植物是一類多年生小型草本植物，土生、附生或生于苔蘚叢中，直立或下垂生長，喜陰涼潮濕環(huán)境。近年來隨著對石杉科植物的開發(fā)和利用，使得石杉科植物資源逐漸減少。因此，對石杉科植物資源有效的合理保護與科學的開發(fā)利用工作己迫在眉睫。本文針對這一狀況，為了解決石杉科藥用植物的資源匱乏問題，保證石杉科藥用植物資源的可持續(xù)開發(fā)和利用，進行設計和研究。本論文首先對我國的石杉科植物的生態(tài)狀況、資源情況、分類情況以及石杉堿甲在

2、石杉科植物中的分布、研究狀況、藥理作用等作了詳細的分析和描述，并著重進行如下研究。 1．對石杉科植物的分子生物學研究利用基因組學對石杉科藥用植物進行研究。通過對不同種石杉科植物的總DNA的提取，選擇葉綠體基因rbcL，rpL16，matK及psbA-trnH間區(qū)進行PCR擴增并測序，通過序列比對并構建系統(tǒng)進化樹進行分析，結果闡明了石杉科植物系統(tǒng)位置和分類關系。系統(tǒng)進化樹中石杉科與石蔥屬Phylloglosum位于系統(tǒng)樹的姊妹枝，

3、共同組成的進化枝與石松科Lycopodiaceae植物平行排列，這一結果與形態(tài)學上的分類方法是一致的，支持了將石杉科獨立于石松科植物的分類觀點。對石杉科的屬下分類，系統(tǒng)進化拓撲樹表明，該科植物中明顯的包含了兩個進化枝，即石杉屬植物進化枝和馬尾杉屬植物進化枝，這一結果提示了石杉科植物中兩個屬的劃分的正確性，確立了石杉科植物的系統(tǒng)分類關系，即石杉屬Huperzia與馬尾杉屬Phlegmariurus的分類方法。這一方法與形態(tài)學的分類方法相輔

4、相成，這一結果是對于捷克植物學家Holub對該屬分類的不確定性的有力的答復。并對屬下的分類做了進一步的研究，系統(tǒng)樹上石杉屬中石杉組和小杉蘭組的植物明顯地被分為兩個聚群，這一結果同張麗兵、孔憲需的分類學觀點相一致。由于馬尾杉屬的供試材料不足，其屬內系統(tǒng)演化結果尚不明朗，有待于進一步的研究。本研究還確立了長柄石杉應為蛇足石杉的一個變種，這一觀點得到了系統(tǒng)樹的支持。伏貼石杉雖然與小杉蘭在形態(tài)學上很難區(qū)分，在系統(tǒng)樹上該兩種植物分別聚于不同的演化

5、枝，并有很高的Bootstrap支持率，這一結果可以明顯的把小杉蘭和伏貼石杉區(qū)分開，伏貼石杉應該為一個獨立的種。 通過對不同基因序列比對并通過遺傳距離及堿基差異的分析，表明了石杉科植物之間存在一定的差別，特別是屬間有較大的差別，為屬間鑒定提供了重要的鑒定依據。一些形態(tài)上相似難以鑒定的種，如蛇足石杉與長柄石杉；東北石杉、伏貼石杉和小杉蘭之間可以通過堿基差異及遺傳距離的不同進行準確的鑒定，為石杉科植物在分子鑒定提供了簡便、可靠的鑒定

6、方法。 2．進行了兩種石杉科植物蛋白質表達譜的研究利用蛋白質組學技術對石杉科藥用植物進行了研究。為探討石杉科植物中主要有效活性成分石杉堿甲生物合成的途徑奠定了基礎。分析比較了石杉堿甲含量差別較大的東北石杉和伏貼石杉中的蛋白質的2-DE表達譜，優(yōu)化了從石杉科植物中提取純化蛋白質的方法。從東北石杉的蛋白質表達譜中分離出蛋白質斑點1338個，從伏貼石杉中分出蛋白質斑點1269個。273個差異蛋白質斑點多集中在分子量在15-75KDa和

7、pH4-7之間。通過對137個成功獲取的蛋白質斑點的鑒定，有60個蛋白質斑點鑒定成功。其中在有貢獻的16個蛋白質斑點中，斑點Ha22號蛋白質存在于石杉堿甲含量高的伏貼石杉中，而不含石杉堿甲的東北石杉中無此斑點，該蛋白質在動物體內為一種絲裂原調節(jié)蛋白：Mrp3，而在植物體內該蛋白質的作用機理尚不清楚，由于該蛋白質是存在于兩種石杉堿甲含量明顯不同，但生長環(huán)境和形態(tài)相似的兩個種中的明顯差別蛋白質，它的存在有可能與石杉堿甲的生源途徑有一定的相關

8、性，因而改變了不同的石杉科植物中的石杉堿甲的含量的高低。另外的15個蛋白質在兩個種都存在著差異，表明，這些有差異的蛋白質都有可能參與了石杉堿甲的生物合成途徑。以上結果還需要進一步的試驗驗證。本實驗為尋找參與石杉堿甲合成的功能基因或蛋白質提供了重要的參考資料。該研究將為對石杉科藥用植物次生代謝產物的生物合成途徑以及與基因和蛋白質的關系的研究奠定了堅實的基礎。 本文研究在國內外尚未見文獻報道，屬國際首創(chuàng)。該研究為中藥植物資源的合理開