基底硬度對人臍靜脈內(nèi)皮細胞黏附THP-1細胞及對其黏附相關(guān)分子表達的影響.pdf

1、作為人類健康的首要“殺手”，心血管疾病(CardioVascular Disease, CVD)越發(fā)被重視?！吨袊难懿蟾?013》中提到，在中國心血管疾病每年剝奪近400萬人的生命，每死亡5人就有2人是因心血管疾病。血管僵化是心血管疾病的普遍特征。吸煙、挑食、運動量少等不良生活習(xí)慣以及年齡的增加促使血管壁彈力蛋白含量降低，而膠原蛋白的量卻與之相反的出現(xiàn)明顯的累積，加之膠原分子間大量的交聯(lián)，最終導(dǎo)致血管僵硬。血管的僵硬為心血管疾病的

2、發(fā)生提供了條件。另一方面，由黏附分子以及趨化因子介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞與免疫細胞的黏附也是心血管疾病的關(guān)鍵步驟之一。有研究表明內(nèi)皮細胞中與黏附相關(guān)的分子會受到多重因素的影響，如細胞所處力學(xué)環(huán)境，相關(guān)基因的異常表達，然而基底硬度變化作為心血管疾病的常見特征，是否會影響內(nèi)皮細胞與其他細胞間的黏附還研究較少。如能發(fā)現(xiàn)血管硬度變化對內(nèi)皮細胞黏附其他種細胞能力的影響，或許能給相關(guān)心血管疾病的防治開拓新的視野。本研究通過調(diào)節(jié)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的比例來

3、得到不同硬度的聚丙烯酰胺水凝膠(Polyarcylamide gel, PA gel)，從而模擬血管正常生理狀態(tài)和病變狀態(tài)下的硬度，進而分析血管壁硬度的不同對血管內(nèi)皮細胞黏附人急性單核白血病細胞(Human acute monocytic leukemia cell, THP-1)以及對內(nèi)皮黏附相關(guān)分子表達的影響。
　　本研究主要內(nèi)容包括：①改變丙烯酰胺(Acrylamide, AM)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis-acrylamide

4、, Bis)的配比得到不同硬度的聚丙烯酰胺凝膠，以Sulfo-SANPAH為媒介將I型鼠尾膠原(Col-I)交聯(lián)于凝膠表面從而活化凝膠。借助動靜態(tài)疲勞試驗機對不同配比的水凝膠的楊氏模量E進行檢測，分別為11.15±0.1kPa，32.51±1.91kPa和80.64±2.11kPa，滿足模擬正常血管和病變血管硬度的要求。隨后，將培養(yǎng)于不同硬度基底上的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial ce

5、lls, HUVECs)與THP-1細胞共培養(yǎng)分析基底硬度對內(nèi)皮細胞黏附THP-1細胞能力的影響，發(fā)現(xiàn)在接近生理硬度(30kPa左右)時內(nèi)皮細胞黏附的THP-1細胞最少。②為排除凝膠表面所裱稱 Col-I對后續(xù)實驗結(jié)果的影響，利用免疫熒光技術(shù)對不同硬度水凝膠表面的Col-I進行分析，發(fā)現(xiàn)隨著硬度的變化Col-I的結(jié)合量并沒有明顯變化。隨后將HUVECs培養(yǎng)于不同硬度的水凝膠上，待細胞長至80％以上，提取細胞的總RNA和全蛋白，利用熒光定

6、量PCR、免疫熒光和免疫印跡技術(shù)分析硬度對內(nèi)皮細胞中與黏附相關(guān)的分子如血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)、細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)、單核細胞趨化因子-1(monocyte chemotactic protein1,MCP-1)等的影響。從實驗結(jié)果可以看出在正常生理硬度(30kP

7、a左右)下內(nèi)皮細胞中與黏附相關(guān)的分子的RNA轉(zhuǎn)錄以及蛋白表達水平均比病理硬度(10kPa左右和80kPa左右)下低。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)于不同硬度水凝膠上的內(nèi)皮細胞中的分化抑制因子-1(inhibitors of differentiation-1,Id1)無論是mRNA水平還是蛋白水平其受影響趨勢均與上述黏附相關(guān)分子一致。③在發(fā)現(xiàn)不同硬度基底上培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞中 Id1因子的 RNA轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達水平的變化趨勢與黏附相關(guān)分子一致的

8、基礎(chǔ)上，我們構(gòu)建了 Id1過表達的HUVECs來研究Id1是否與基底硬度影響內(nèi)皮中與黏附相關(guān)的分子的表達有關(guān)。對轉(zhuǎn)染細胞中Id1的RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達進行檢測，確定獲得穩(wěn)定Id1高表達細胞后，通過熒光定量PCR和免疫印跡技術(shù)分析Id1過表達后內(nèi)皮細胞中的與黏附相關(guān)的分子的 RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白表達水平。結(jié)果顯示Id1過表達時黏附分子的 RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達量也都增加，類似于病理硬度水凝膠上所得結(jié)果。通過本研究工作我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞生長環(huán)境的硬