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文檔簡介
1、目的:
核糖核酸酶Ⅲ核酸內(nèi)切酶Dicer1是MicroRNA合成的關鍵酶之一,主要位于細胞胞質(zhì)中。在卵巢腫瘤的研究中,卵巢癌患者伴有Dicer1基因的異常調(diào)節(jié)往往提示預后不良。但是至今有關Dicer1基因如何影響卵巢癌的生物學特性和化療耐藥的研究并不是很清楚。因此本實驗的研究主要目的是在卵巢癌細胞株C13K中,下調(diào)Dicer1基因可以誘導自噬參與卵巢癌的化療耐藥的探索。
方法:
本實驗主要的實驗方法是:(1
2、)運用細胞增殖與毒性實驗(CCK8)來檢測下調(diào)Dicer1基因后卵巢癌細胞株C13K順鉑的敏感性及半數(shù)抑制濃度(IC50)。(2)利用小干擾RNA(siRNA)技術進行下調(diào)卵巢癌細胞株C13K中的Dicer1基的表達量和下調(diào)Dicer1基因后對順鉑的敏感性以及加入抑制自噬的藥物(3-MA)后是否逆轉(zhuǎn)這種耐藥效應,其次通過蛋白質(zhì)印記(western blot)觀察Dicer1和自噬相關的關鍵基因(ATG5,LC3B)在下調(diào)Dicer1基因
3、后卵巢癌細胞株C13K的表達量以及下調(diào)Dicer1基因并且順鉑處理后凋亡蛋白(Caspase3,c-PARP)的表達量。(3)通過透射電子顯微鏡及共聚焦激光掃描顯微鏡技術,來觀察Dicer1基因下調(diào)以及順鉑處理后卵巢癌細胞的自噬體的變化。(4)通過流式細胞學實驗技術,來觀察Dicer1-si,ATG5-si以及順鉑處理后細胞凋亡的情況。(5)通過運用公共數(shù)據(jù)庫TCGA,我們研究了Dicer1基因和ATG5基因在卵巢癌病人中的表達與預后的
4、關系。
結(jié)果:
根據(jù)以上實驗數(shù)據(jù)及現(xiàn)象,可以得到如下結(jié)果:(1)通過CCK8發(fā)現(xiàn)卵巢癌細胞株C13K在Dicer1基因下調(diào)后對化療藥物順鉑的耐藥性增加。(2)通過siRNA干擾和western blot發(fā)現(xiàn)下調(diào)Dicer1基因在卵巢癌細胞株(C13K)的表達后,凋亡蛋白(Caspase3,c-PARP)表達也降低且加入自噬抑制劑(3MA)可以逆轉(zhuǎn)這種耐藥效應。(3)通過透射電子顯微鏡和熒光共聚焦激光掃描顯微鏡發(fā)現(xiàn)Di
5、cer1下調(diào)后以及順鉑處理后,自噬現(xiàn)象比較明顯。(4)在TCGA數(shù)據(jù)庫中,發(fā)現(xiàn)Dicer1基因表達量低的患者預后較差,自噬基因(ATG5)表達量高的患者預后不良。(5)我們把自噬形成的關鍵基因(ATG5)沉默以及使用藥物抑制自噬生成后,發(fā)現(xiàn)C13K對順鉑的敏感性增加。
結(jié)論:
通過以上實驗數(shù)據(jù)的結(jié)果分析,我們可以得出一個這樣的結(jié)論即在卵巢癌細胞株C13K中,Dicer1下調(diào)可以誘導自噬的發(fā)生進而促進卵巢癌細胞對化療藥
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