基于鈣羧酸熒光淬滅原理的磷酸化蛋白檢測(cè).pdf

1、目的：
　　蛋白質(zhì)組學(xué)目前在生命科學(xué)領(lǐng)域中擁有其特殊而重要的地位，關(guān)于各類蛋白與疾病的關(guān)系研究也成為了眾多科研工作者研究的熱點(diǎn)，其中，磷酸化蛋白在許多交叉學(xué)科中經(jīng)常涉及，因此也產(chǎn)生了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)這一新型的蛋白質(zhì)組學(xué)分支。研究的主要內(nèi)容包括磷酸化蛋白質(zhì)的分離與檢測(cè)，磷酸化蛋白質(zhì)與疾病因子的關(guān)系研究等等。其中關(guān)于蛋白質(zhì)的分離與檢測(cè)成為了后續(xù)研究的基礎(chǔ)，在研究過(guò)程中則經(jīng)常應(yīng)用到聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白與鈣羧酸熒光檢測(cè)磷酸化蛋白。

2、>　　在聚丙烯酰胺凝膠上建立一種具有快速、靈敏、特異等特點(diǎn)的磷酸化蛋白檢測(cè)方法，能夠在短時(shí)間內(nèi)靈敏、精確、特異地檢測(cè)到磷酸化蛋白，同時(shí)可以兼容其他常規(guī)染色檢測(cè)方法，并且與質(zhì)譜也具有良好的兼容性，或通過(guò)與其他儀器技術(shù)的聯(lián)用，能夠幫助解決磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究過(guò)程中的薄弱環(huán)節(jié)問(wèn)題即缺少特異靈敏的特異性蛋白檢測(cè)手段，從而幫助蛋白質(zhì)組學(xué)研究過(guò)程中有關(guān)于蛋白質(zhì)的定性、定量分析等問(wèn)題的解決，起到促進(jìn)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展的作用的目的。
　　方法

3、：
　　(1)聚丙烯酰胺凝膠是目前廣泛應(yīng)用的一種蛋白分離技術(shù)，可以根據(jù)蛋白質(zhì)樣品的不同分子量和等電點(diǎn)來(lái)有效分離混合樣品中的不同蛋白，方便應(yīng)用與后期的蛋白檢測(cè)及其他蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，故而成為最可靠的一種蛋白分離技術(shù)。本課題中應(yīng)用在聚丙烯酰胺凝膠上（1D和2D）分離目標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品混合蛋白和實(shí)際樣品，建立一種關(guān)于磷酸化蛋白質(zhì)特異性檢測(cè)的方法。
　　(2)通過(guò)研究鈣羧酸(CCA)熒光的特性，利用鈣羧酸在不同化學(xué)微環(huán)境（多種有機(jī)試劑，不同

4、pH環(huán)境）以及與不同類型蛋白質(zhì)（磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白）作用下的熒光性質(zhì)的不同，經(jīng)過(guò)大量的篩選，以特異性為優(yōu)先篩選條件，靈敏度為第二提高的目標(biāo)，建立一種特異性的檢測(cè)磷酸化蛋白的方法。
　　(3)方法建立后，為了避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)，采取通過(guò)與Pro-Diamond(PD)試劑盒、Western Blot等現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證的方法，多重證明CCA磷酸化檢測(cè)方法的特異性;通過(guò)質(zhì)譜鑒定，對(duì)檢測(cè)到的蛋白條帶進(jìn)行更深入的分析，

5、更具說(shuō)服力地驗(yàn)證CCA檢測(cè)方法的特異性、準(zhǔn)確性，并找到相應(yīng)的磷酸化修飾位點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立了一種快速、特異、靈敏的以CCA熒光淬滅原理為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，詳細(xì)步驟如下:
　　(1)染色:將電泳之后的凝膠放置于50 mL含有50μM鈣羧酸（母液溶解于水中），20％1，2-丙二醇，0.5％醋酸的染色液中染色25min;
　　(2)脫色:將染色完畢的凝膠放置于50 mL含有80μM AL3+，10％甘油，

6、100 mM醋酸鈉脫色液中脫色20 min。
　　(3)通過(guò)成像裝置，在一定的激發(fā)波長(zhǎng)條件下拍攝圖像，儲(chǔ)存。
　　2.通過(guò)與PD試劑盒、Western Blot進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，去磷酸化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證特異性并通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)磷酸化修飾位點(diǎn)等實(shí)驗(yàn)，最終證明了CCA方法具有特異性較好，檢測(cè)限高，線性關(guān)系好，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)?？梢詫?shí)際應(yīng)用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中特異性的檢測(cè)磷酸化蛋白。
　　3.為了可以實(shí)現(xiàn)方法的產(chǎn)業(yè)化、市場(chǎng)化，我們將

7、所建立的鈣羧酸磷酸化蛋白檢測(cè)方法放置于不同氣候的不同實(shí)驗(yàn)場(chǎng)合，在不同外界條件下進(jìn)行多次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以保證方法的穩(wěn)定性。
　　結(jié)論：
　　CCA檢測(cè)法具有操作方便（僅2步）、檢測(cè)限低（4-8ng，好于PD試劑盒）、特異性好（優(yōu)于PD試劑）、實(shí)驗(yàn)時(shí)間短(45min)等優(yōu)點(diǎn)，可以在短時(shí)間內(nèi)特異性高靈敏的檢測(cè)到磷酸化蛋白，這正好可以幫助解決磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中缺少好的磷酸化蛋白檢測(cè)方法的這一問(wèn)題，可為磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展提供幫助，是